張?zhí)戾a，史 磊，馮 帥，楊 敏，李 健，李 峰*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部,山東 濟南 250014)

紫錐菊Echinaceapupurea(L.)Moench.來源于菊科紫錐菊屬多年生草本植物[1]，具有顯著的免疫促進作用和抗細菌、抗病毒感染能力，其提取物在歐美被廣泛應(yīng)用于藥品、營養(yǎng)補充劑、保健食品中[2-5]，它含有多種成分，如酚酸衍生物、烷基酰胺、多糖、揮發(fā)油、生物堿、黃酮、多炔等[6-7]。國內(nèi)大多以紫錐菊的地上部分為原料[8-9]，其乙醇提取物含有豐富的咖啡酸衍生物[10-12]，其中菊苣酸已被證實具有抗呼吸道合胞病毒(RSV)[13]、抗流感、提高免疫作用[14-17]。吳啟林[18]采用大孔吸附樹脂純化菊苣酸，測定其純度為20.2%左右；曾棟[19]以同法純化該成分，7%甲醇洗脫后發(fā)現(xiàn)其純度為36%，可知純度不高、純化過程中損失較多是目前阻礙其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此，本實驗優(yōu)化紫錐菊中菊苣酸大孔吸附樹脂純化工藝，以期為該成分進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 紫錐菊購自青州市康達中藥材種植專業(yè)合作社(批號2019072432)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為菊科植物紫錐菊屬紫錐菊Echinaceapupurea(L.)Moench的干燥地上部分。

1.2 儀器 Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；CPA 2250型電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；TDL-5-A型低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 試劑與藥物 AB-8、HPD600、HPD826、D101、DM130、HPD100型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，物理性能見表1。菊苣酸對照品(批號111752-200902，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇(批號190259)、乙腈(批號AS1122-801)為色譜純(美國Fisher公司)；其余試劑均為分析純(天津市富宇精細化工有限公司)。

表1 大孔吸附樹脂物理性能

2 方法與結(jié)果

2.1 菊苣酸含量測定

2.1.1 色譜條件 參照文獻[20]報道。ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，程序見表2；體積流量1.5 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫35 ℃；進樣量5 μL。色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序

1.菊苣酸圖1 菊苣酸HPLC色譜圖

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取菊苣酸對照品適量，置于25 mL棕色量瓶中，70%甲醇溶解并定容至刻度，即得(菊苣酸質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液制備 藥材粉碎后過60目篩，取細粉約0.4 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-0.5%磷酸(5∶1)混合溶液75 mL,稱定質(zhì)量，室溫下超聲提取60 min，混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，收集濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液100、200、400、500、600、1 000 μL，置于1 mL量瓶中，70%甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以菊苣酸質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，得到方程為Y=15.432X-212.44(r=0.999 6)，在60～600 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.4”項下溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得菊苣酸峰面積RSD為0.26%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一批藥材干燥粉末，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得菊苣酸含量RSD為1.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液1份，精密移取1 mL至EP管中，加入2 mL 70%甲醇醇沉5 min后定容至5 mL，于0、2、4、6、8、12 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得菊苣酸峰面積RSD為0.68%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一批藥材干燥粉末，精密稱取0.400 0 g，精密加入適量“2.1.2”項下對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得菊苣酸平均加樣回收率為101.61%，RSD為2.3%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 上樣液制備 取藥材700 g，60%乙醇回流提取3次，設(shè)定料液比分別為1∶10、1∶8、1∶6，提取時間分別為1.5、1、1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，離心，取上清液，調(diào)節(jié)pH至2，抽濾，即得。

2.2.2 大孔吸附樹脂預(yù)處理 取適量樹脂，95%乙醇浸泡24 h后洗至溶液無白色穢濁異物，再用蒸餾水洗至無醇味，備用。

2.2.3 大孔吸附樹脂類型篩選 將AB-8、HPD600、HPD826、D101、DM130、HPD100型樹脂預(yù)處理后進行抽濾，分別精密稱取1.000 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入含2.7 mg/mL菊苣酸的上樣液20 mL，置于搖床中靜態(tài)吸附，轉(zhuǎn)速80 r/min，12 h后吸取上樣液，HPLC法測定菊苣酸含量。過濾樹脂后，去離子水清洗樹脂表面殘存溶液，再轉(zhuǎn)移到另一具塞錐形瓶中，加入30%乙醇50 mL，置于搖床中解吸附12 h，解吸液在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率為指標篩選樹脂類型，結(jié)果見表3，可知HPD-100、HPD-826、AB-8型吸附量均較大，但前兩者解吸量、解吸率較低，故最終確定為AB-8型。

表3 6種大孔吸附樹脂對菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率的影響(n=3)

2.2.4 靜態(tài)吸附曲線繪制 稱取AB-8型樹脂5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL上樣液進行靜態(tài)吸附，每10 min取樣1次，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，繪制靜態(tài)吸附曲線，結(jié)果見圖2。由此可知，隨著吸附時間延長，樹脂吸附量逐漸增大，前期較快，后期較慢，吸附平衡時間為180 min，最大吸附量為80 mg。

圖2 AB-8型樹脂靜態(tài)吸附曲線

2.2.5 上樣液pH篩選 由于菊苣酸在pH低于2時極易分解，穩(wěn)定性差，故選擇pH高于2的條件進行考察。將上樣液(pH=5.6)平均分為6份，每份20 mL，6 mol/L HCl、10%NaOH溶液分別調(diào)pH至相應(yīng)值，置于含1 g AB-8樹脂的250 mL具塞錐形瓶中，搖床上靜態(tài)吸附12 h，取樣檢測。過濾樹脂，去離子水清洗樹脂表面殘存的溶液，轉(zhuǎn)移至已包好錫箔紙的250 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 30%乙醇解吸12 h，洗脫液在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算比吸附量、解吸量、解吸率，結(jié)果見表4。由此可知，當pH為2時AB-8型樹脂比吸附量、解吸量最大。

表4 上樣液pH對菊苣酸比吸附量、解吸量、解吸率的影響(n=3)

2.2.6 上樣液質(zhì)量濃度篩選 量取pH為2的上樣液200 mL，以2 BV/h的體積流量加到徑高比1∶5的樹脂柱內(nèi)循環(huán)吸附3 h，收集循環(huán)液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算吸附量、吸附率，結(jié)果見表5。由此可知，隨著上樣液質(zhì)量濃度增加，吸附量呈遞增趨勢，但泄漏量也隨之增大，從而大大降低吸附效率，增加生產(chǎn)成本，最終選擇2～3 mg/mL作為上樣液質(zhì)量濃度。

表5 上樣液質(zhì)量濃度對菊苣酸吸附量、吸附率的影響(n=3)

2.2.7 上樣體積流量篩選 量取4份質(zhì)量濃度2.62 mg/mL、pH 2的上樣液，于徑高比1∶5的層析柱內(nèi)調(diào)節(jié)吸附速度為相應(yīng)數(shù)值，循環(huán)吸附3 h，量取500 mL蒸餾水至層析柱中，洗去樹脂表面殘存的上樣液，收集水液與流出液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算吸附量、吸附率，結(jié)果見表6。由此可知，隨著上樣體積流量增加，樹脂吸附量逐漸降低，吸附率也隨之減少，為確保樹脂的最大吸附量，最終選擇2 BV/h作為上樣體積流量。

表6 上樣體積流量對菊苣酸吸附量、吸附率的影響(n=3)

2.2.8 徑高比篩選 選取徑高比1∶3、1∶5、1∶7、1∶9的玻璃柱，以AB-8型樹脂進行濕法裝柱，調(diào)節(jié)上樣體積流量為2 BV/h，量取200 mL藥液至層析柱中，收集液循環(huán)吸附3 h，再量取500 mL蒸餾水至層析柱中，洗去樹脂表面殘存上樣液，收集水液與流出液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算吸附量、吸附率，結(jié)果見表7。由此可知，徑高比越大，吸附率越高，故不能作為選擇徑高比的指標，可改為比吸附量，當徑高比為1∶5時最大，最終選擇1∶5作為徑高比。

表7 徑高比對菊苣酸吸附量、吸附率的影響(n=3)

2.2.9 泄露曲線繪制 量取適量樹脂裝入層析柱中，使其徑高比為1∶5，量取400 mL 質(zhì)量濃度為2.76 mg/mL、pH為2的藥液加到層析柱中，以2 BV/h體積流量進行動態(tài)吸附，每只試管收集10 mL流出液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，繪制泄露曲線，結(jié)果見圖3。由此可知，在上樣量為100 mL時發(fā)生泄漏；為130 mL時，泄漏量為菊苣酸原質(zhì)量濃度的10%，為確保該成分吸附完全，最終選擇130 mL作為上樣量，即4 BV。

圖3 菊苣酸泄露曲線

2.2.10 洗脫劑(乙醇)體積分數(shù)篩選 表8顯示，在乙醇體積分數(shù)為30%、50%時，菊苣酸解吸量、解吸率較大，考慮到經(jīng)濟因素，最終選擇30%作為洗脫劑體積分數(shù)。

表8 洗脫劑體積分數(shù)對菊苣酸解吸量、解吸率的影響(n=3)

2.2.11 洗脫體積流量篩選 量取上樣液130 mL，置于徑高比1∶5的層析柱中，以2 BV/h體積流量循環(huán)吸附3 h，加入蒸餾水3 BV(pH=2)，當流出液經(jīng)Molish反應(yīng)呈陰性時，加入500 mL 30%乙醇，在2、3、4 BV/h體積流量下洗脫，收集洗脫液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算解吸量、解吸率，結(jié)果見表9。由此可知，在2、4 BV/h體積流量下解吸率相近，考慮到經(jīng)濟效益，最終選擇4 BV/h作為洗脫體積流量。

表9 洗脫體積流量對菊苣酸解吸量、解吸率的影響(n=3)

2.2.12 洗脫曲線繪制 設(shè)定解吸條件為上樣液質(zhì)量濃度為2.7 mg/mL，pH為2，上樣體積流量為2 BV/h，上樣體積為130 mL，取3份上樣液至徑高比為1∶5的層析柱中，動態(tài)循環(huán)吸附3 h，加入3 BV蒸餾水使流出液經(jīng)Molish反應(yīng)呈陰性，加入30%乙醇洗脫，收集洗脫液，每管10 mL，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，繪制洗脫曲線，結(jié)果見圖4。由此可知，洗脫體積為11 BV時可將菊苣酸完全洗脫下來，并且該成分富集化部位主要集中在5 BV，此時其純度為36.5%，解吸率為80.2%，故選擇5 BV作為洗脫體積。

圖4 菊苣酸洗脫曲線

2.3 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇上樣液質(zhì)量濃度(A)、上樣液pH(B)、洗脫體積流量(C)、洗脫劑體積分數(shù)(D)作為影響因素，解吸率(Y)作為評價指標，因素水平見表10，結(jié)果見表11，方差分析見表12。由此可知，各因素影響程度依次為D>B>A>C，最優(yōu)工藝為A3B2C2D3，即上樣液質(zhì)量濃度3 mg/mL，上樣液pH 3，洗脫體積流量3 BV/h，洗脫劑體積分數(shù)35%。

表10 因素水平

表11 試驗設(shè)計與結(jié)果

表12 方差分析

2.4 驗證試驗 將“2.3”項下結(jié)果進行3批驗證試驗，結(jié)果見表13。

表13 驗證試驗結(jié)果(n=3)

3 討論

本實驗創(chuàng)新之處在于大孔樹脂洗脫溶劑的選擇較前期文獻有所改進，采用純化水(pH=3)、不同體積分數(shù)乙醇梯度洗脫的方式進行除雜，既減少了菊苣酸在純化過程中的損失，又能使該成分洗脫富集化，從而其平均純度可達到52.00%，較純化前提高了近8倍。但菊苣酸對溫度較敏感，在洗脫液減壓濃縮過程中溫度過高會造成該成分損失較大，故今后將系統(tǒng)考察溫度對其穩(wěn)定性的影響。

綜上所述，紫錐菊中菊苣酸最優(yōu)大孔吸附樹脂純化工藝為AB-8大孔吸附樹脂，上樣液質(zhì)量濃度3 mg/mL，上樣液pH 3，洗脫體積流量3 BV/h，洗脫劑體積分數(shù)35%，洗脫體積5 BV，能達到較好的分離純化效果，具有成分損失少、吸附量大、吸附速度快、易于解吸附、樹脂再生處理簡單、使用周期長等優(yōu)點，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。同時可有效地提高提取物中該成分純度，為其后續(xù)精制奠定基礎(chǔ)。