符譯尹，蒲梅婷，潘田芬，陸志夫，于 樂(lè)

(1.三亞市人民醫(yī)院，海南 三亞 572000；2.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?571103；3.九江市第一人民醫(yī)院，江西 九江 332000)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是以對(duì)稱(chēng)性多關(guān)節(jié)炎病變?yōu)橹鞯娜硇匝装Y性自身免疫疾病，多發(fā)于30～55歲[1-3]，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，涉及到多個(gè)免疫系統(tǒng)的相關(guān)因子水平[4]，該病反復(fù)遷延性、對(duì)稱(chēng)性會(huì)合并多個(gè)小關(guān)節(jié)病變[5]，而且伴隨滑膜炎、血管炎、軟骨破壞[6]，早期癥狀為關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛及功能障礙，晚期關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形，影響患者生活水平和生存質(zhì)量[7-8]。芍藥干燥根中提取的糖苷類(lèi)物質(zhì)白芍總苷是其主要成分[9]，能通過(guò)多種途徑抑制人體自身免疫反應(yīng)，有抗菌、鎮(zhèn)痛等作用，對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有療效[10]。NF-κB信號(hào)通路在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中有2個(gè)作用：一是活化后調(diào)動(dòng)促炎相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，如IL-6等；二是促進(jìn)IκBα磷酸化和p65向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而加重炎癥反應(yīng)[11]。本研究探討白芍水煎液對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的臨床療效對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 2019年1月至2020年10月收治于三亞市人民醫(yī)院的200例類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，男性135例，女性65例，隨機(jī)分為對(duì)照組及白芍水煎液高、中、低劑量組。其中，對(duì)照組男性33例，女性16例，病程(4.9±2.2)年；白芍水煎液高劑量組男性34例，女性17例，病程(4.8±2.3)年；白芍水煎液中劑量組男性34例，女性17例，病程(4.9±2.5)年；白芍水煎液低劑量組男性34例，女性15例，病程(4.8±1.9)年，4組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究經(jīng)三亞市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合ACR(自體細(xì)胞再生)聯(lián)合EULAR(歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會(huì))提出的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)；(2)膝關(guān)節(jié)滑膜組織取自療程結(jié)束需行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者；(3)患者了解本研究，簽署知情同意書(shū)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)合并感染；(2)合并腫瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病。

1.4 材料 白芍(仁和大藥房)。蛋白提取試劑盒(北京天壇生物制品股份有限公司)；p-p65抗體、p-IκBα抗體、IL-6抗體、IL-17A抗體、IL-10抗體、山羊抗兔二抗(遼寧成大生物股份有限公司)；DAB顯色盒、NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒、蘇木精染色液(上海萊士血液制品股份有限公司)；共聚焦熒光顯微鏡、石蠟切片機(jī)(上海豐實(shí)試驗(yàn)儀器有限公司)。

1.5 治療手段 將80 g白芍加到500 g清水中，水煎1.5 h后得到水煎液，低、中、高劑量組患者每天每次分別口服15、30、45 mg；對(duì)照組不給予任何藥物。4組療程均為12周。

1.6 療效評(píng)價(jià) 參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道，(1)顯效，晨僵、腫脹、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀完全消失,體征、睡眠達(dá)到正常水平；(2)有效，晨僵、腫脹、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀有所改善,體征、睡眠基本達(dá)到正常水平；(3)無(wú)效，晨僵、腫脹、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀無(wú)顯著改善甚至加劇，體征狀況出現(xiàn)異常,睡眠嚴(yán)重受到影響，總有效率=[(有效例數(shù)+顯效例數(shù))/總例數(shù)]×100%。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 晨僵時(shí)間 檢測(cè)患者從早晨感受關(guān)節(jié)僵硬到恢復(fù)正常所用的時(shí)間，即為晨僵時(shí)間。

1.7.2 癥狀評(píng)分 采用疼痛數(shù)字評(píng)分法(NRS)評(píng)價(jià)患者關(guān)節(jié)疼痛程度，總分10分，分值越高，疼痛越強(qiáng)烈。再采用容積法評(píng)價(jià)患者關(guān)節(jié)腫脹度。

1.7.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 包括血沉(ESR)、血清 C 反應(yīng)蛋白(CRP)、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)，患者于每天上午7：00采集空腹肱靜脈血10 mL，離心取血清，采用XT-2000型SYSMEX 全自動(dòng)血液分析儀、HITACHI 7060型全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)上述指標(biāo)。

1.7.4 檢測(cè)血清p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10水平檢測(cè) 采用Western blotting法。按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，提取患者血清中相關(guān)蛋白，測(cè)定其濃度，SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉1.5 h，加入p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10抗體(1∶800)，在6 ℃下孵育過(guò)夜。TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 500)，在5 ℃下孵育1.5 h。TBST液洗滌3次，每次10 min，最后條帶經(jīng)Bio-RAD凝膠分析儀進(jìn)行圖像掃描分析灰度值測(cè)定，以p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10與GADPH灰度值的比值表示各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7.5 NF-κB p65核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè) 采用免疫熒光染色法。取患者空腹肱靜脈血，離心取血清，重懸于培養(yǎng)液中，以每孔210個(gè)的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞鋪底80%左右時(shí)吸除培養(yǎng)液，檢測(cè)NF-κB p65轉(zhuǎn)運(yùn)，具體操作步驟按NF-κB激活-核轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，封片后，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.7.6 T細(xì)胞分化檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織制成標(biāo)準(zhǔn)石蠟切片，依次在二甲苯Ⅰ中浸泡5 min、二甲苯Ⅱ中浸泡5 min、乙醇中浸泡2 min、95%乙醇中浸泡3 min、85%乙醇中浸泡3 min、75%乙醇中浸泡3 min脫蠟，蒸餾水沖洗3 min，過(guò)氧化氫-甲醇溶液中浸泡10 min，PBS沖洗3次，滴加1∶800稀釋一抗覆蓋組織，在5 ℃下孵育過(guò)夜，次日PBS沖洗5 min(共3次)，二抗在40 ℃下孵育2 h，PBS沖洗5 min，滴加DAB顯色液，自來(lái)水沖洗，蘇木精染色2～3 min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水返藍(lán)20 min，記錄顯色情況，中性樹(shù)膠封片，觀察染色結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 白芍水煎液各劑量組總有效率高于對(duì)照組(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表1。

表1 4組臨床療效比較(n=50)Tab.1 Comparison of clinical efficacy among the four groups (n=50)

2.2 晨僵時(shí)間、癥狀評(píng)分 治療后，白芍水煎液各劑量組晨僵時(shí)間短于對(duì)照組(P<0.05)，關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分、關(guān)節(jié)腫脹度評(píng)分更低(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表2。

表2 4組晨僵時(shí)間、癥狀評(píng)分比較Tab.2 Comparison of morning stiffness time and symptom scores among the four groups n=50)

2.3 ESR、CRP、RF水平 治療后，白芍水煎液各劑量組ESR、CRP、RF水平低于對(duì)照組(P<0.05)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表3。

表3 4組ESR、CRP、RF水平比較Tab.3 Comparison of ESR,CRP and RF levels among the four groups n=50)

2.4 血清p-p65、p-IκBα水平 患者給予白芍水煎液后，血清p-p65、p-IκBα水平明顯受到抑制，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖1。

圖1 4組血清p-p65、p-IκBα水平Fig.1 Serum p-p65 and p-IκBα levels in four groups

2.5 NF-κB p65核轉(zhuǎn)運(yùn) 對(duì)照組NF-κB p65大多位于細(xì)胞核中，少數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中；白芍水煎液各劑量組NF-κB p65水平在細(xì)胞核內(nèi)逐漸減少，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)圖2。

圖2 4組NF-κB p65核轉(zhuǎn)運(yùn)Fig.2 NF-κB p65 nuclear transports in four groups

2.6 T細(xì)胞分化 白芍水煎液高劑量組Th17細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組(P<0.05)，而Treg細(xì)胞數(shù)量增加(P<0.05)；患者給予白芍水煎液后，T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化減少，T細(xì)胞向Treg細(xì)胞的分化增加，使原本失調(diào)的免疫調(diào)節(jié)功能得到一定恢復(fù)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：A為對(duì)照組Th17細(xì)胞，B為白芍水煎液高劑量組Th17細(xì)胞，C為對(duì)照組Treg細(xì)胞，D為白芍水煎液高劑量組Treg細(xì)胞。圖3 2組T細(xì)胞分化Fig.3 T cell differentiation in two groups

2.7 IL-6、IL-17A、IL-10水平 白芍水煎液各劑量組IL-6、IL-17A水平低于對(duì)照組(P<0.05)，IL-10水平更高(P<0.05)，見(jiàn)表4。相關(guān)性分析顯示，IL-6水平與IL-17A水平呈正相關(guān)關(guān)系，而IL-6水平與IL-10水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖4。

表4 4組IL-6、IL-17A、IL-10水平比較Tab.4 Comparison of IL-6,IL-17A and IL-10 levels among the four groups n=50)

注：A為Western blotting檢測(cè)IL-6、IL-17A、IL-10水平，B、C分別為IL-6水平與IL-17A、IL-10水平的相關(guān)性分析。圖4 4組IL-6、IL-17A、IL-10水平及相關(guān)性分析Fig.4 IL-6,IL-17A and IL-10 levels in four groups and correlation analysis

3 討論

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是集骨纖維化、骨質(zhì)破壞、軟骨吸收、慢性炎性反應(yīng)于一身的慢性自身免疫性疾病，主要病因是體內(nèi)缺乏內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素[13]，臨床治療大多采用非甾體消炎藥、免疫抑制類(lèi)藥物，同時(shí)內(nèi)源性腎上腺皮質(zhì)激素也有抗炎效果[14]。NF-κB是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，可激活I(lǐng)κBα磷酸化，增加抗炎性p65活性及下游促炎因子IL-6表達(dá)，并聯(lián)動(dòng)其他炎癥因子表達(dá)[15-16]。健康人體內(nèi)的T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡，而患上類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎后其穩(wěn)態(tài)平衡打破，細(xì)胞過(guò)度的向促炎性的T細(xì)胞亞群分化。目前，大量學(xué)者從人體自身免疫調(diào)節(jié)出發(fā)，尋找治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物靶點(diǎn)[17-18]，并且分析白芍在治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面有優(yōu)勢(shì)[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，白芍水煎液干預(yù)后類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者總有效率顯著提升，臨床不良癥狀顯著減輕，并呈劑量依賴(lài)性；患者血清p-p65、p-IκBα表達(dá)受到抑制，并呈劑量依賴(lài)性，說(shuō)明調(diào)節(jié)過(guò)程與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)；膝關(guān)節(jié)滑膜組織中的促炎細(xì)胞Th17較對(duì)照組顯著減少，抑炎細(xì)胞Treg顯著增加，表明T細(xì)胞向Th17細(xì)胞的分化減少，向Treg細(xì)胞的分化增加，免疫調(diào)節(jié)功能增強(qiáng)；患者血清IL-6、IL-17A表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，IL-10表達(dá)顯著升高；IL-6表達(dá)與IL-17A表達(dá)呈正相關(guān)，與IL-10表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明白芍水煎液通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制Th17細(xì)胞分泌的促炎性細(xì)胞因子IL-17A，促進(jìn)Treg分泌的抗炎性細(xì)胞因子IL-10，從而增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能。

綜上所述，白芍水煎液可改善類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)病情進(jìn)展有阻斷作用，臨床應(yīng)用前景較好。但其他炎性細(xì)胞(如漿細(xì)胞等)在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用尚不明確，需作進(jìn)一步探索。