黃莉容，張馨月，曾 銳，劉明華，孫 琴*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，2017新版慢性阻塞性肺病全球倡議，將COPD定義為一種常見的以氣流受限和持續(xù)性呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的，可以預(yù)防和治療的肺部疾病[1-2]。COPD實質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞浸潤刺激大量的炎性因子釋放，引起黏液分泌增加，同時出現(xiàn)免疫功能異常，尤其是免疫細(xì)胞功能紊亂[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)為應(yīng)激蛋白激酶，幾乎參與生物體內(nèi)全部的病理、生理過程，特別是氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等，磷酸化的p38MAPK可激活大量轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)炎性因子等多種基因的表達(dá)[4-6]。復(fù)方紅景參丸為治療慢性阻塞性肺病的臨床經(jīng)驗方，君藥為紅景天、人參；臣藥有麥冬、金釵石斛；佐以丹參制成中藥丸劑，具有益氣活血，健脾潤肺的功效，適用于缺氧亞健康人群。本研究采用煙熏和氣道滴入脂多糖(LPS)構(gòu)建慢性阻塞性肺炎模型大鼠，研究復(fù)方紅景參丸對COPD模型大鼠肺功能、炎性因子及p38MAPK通路的影響，旨在將復(fù)方紅景參丸開發(fā)為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，并為臨床用于COPD提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 復(fù)方紅景參丸(工藝路線為紅景天、麥冬和石斛水提，人參、丹參打粉)為棕褐色濃縮丸，氣微，味微苦，每1 g含紅景天苷(C14H20O7)不得少于1.28 mg，含人參皂苷Rg1、Re、Rb1總量不得少于2.02 mg，由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備，大鼠給藥劑量按生藥量計算。氨茶堿片(國藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司，批號H19021214，規(guī)格0.1 g)。白三烯(LTB4)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)酶聯(lián)免疫吸法ELISA試劑盒及蘇木精-伊紅(HE)染色液，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；中華牌香煙(上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，含焦油10 mg、尼古丁1.0 mg、煙氣一氧化碳量13 mg)；組織蛋白提取試劑，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；一抗兔抗鼠TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體，購自美國CST公司；二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，4～5周齡，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，實驗動物使用許可證號SYXK(川)2018-24，飼養(yǎng)于SPF級動物室中，相對濕度為40%～70%，溫度為20～25 ℃，換氣次數(shù)為10～12次/h,保持12 h/12 h光照循環(huán)，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、氨茶堿組及復(fù)方紅景參丸低、中、高劑量組，每組10只，空白對照組大鼠正常飼養(yǎng)，其余50只通過煙熏和LPS氣道滴入法建立COPD模型，每天煙霧暴露2次，每次30 min，煙熏箱規(guī)格為60 cm×40 cm×30 cm，每次點燃15支中華香煙，連續(xù)處理28 d；于實驗起第1、14天，10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，向氣管內(nèi)注入1 mg/kg LPS[6]。在第2次注射LPS后開始，復(fù)方紅景參丸低、中、高劑量組每天分別灌胃給予1.17、2.33、3.5 g生藥/kg，氨茶堿組灌胃給予160 mg/kg氨茶堿，空白對照組和模型對照組灌胃給予等容量生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察 觀察并記錄各組大鼠體質(zhì)量、呼吸有無咳嗽、氣急、喘鳴等情況，攝食量、毛發(fā)及其他異常變化。

2.3 大鼠肺功能指標(biāo)檢測 大鼠灌胃給藥4周后，腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg麻醉，暴露氣管后切開，插入連接有三通管的插管，其另一端與FlexiVent動物肺功能儀相連，待大鼠蘇醒后檢測用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、第0.1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV0.1)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)[7]。

2.4 大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)及分類 大鼠腹主動脈采血后撤走三通管，打開胸腔暴露肺臟，將右肺門用手術(shù)線結(jié)扎，左肺通過插管緩慢注入5 mL生理鹽水，洗滌3次，洗滌液離心棄上清，200 μL PBS重懸沉淀，取20 μL懸液，在顯微鏡下統(tǒng)計白細(xì)胞總數(shù)。將剩余懸液制成細(xì)胞涂片，進(jìn)行瑞氏-吉姆染色，在顯微鏡下統(tǒng)計200個細(xì)胞中肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的數(shù)目。

2.5 HE染色 剪取右肺，PBS洗滌后10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，封片，在光鏡下觀察，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。

2.6 大鼠炎性因子水平檢測 肺功能測定完成后，大鼠腹主動脈采血，收集的血液室溫放置4 h后離心，取上層血清置于-20 ℃?zhèn)溆?。臨用前平衡至室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，檢測血清炎性指標(biāo)LTB4、IL-6、IL-1、TNF-α的水平。

2.7 Western blot分析 肺功能測定完成后，剪下大鼠前葉肺組織，在液氮下凍存?zhèn)溆?，實驗時取出，加入RIPA裂解液充分研磨后勻漿，提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，上樣量為50 μg，在80～120 V下進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠膠電泳，100 V下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌后加1∶1 000稀釋的一抗(TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK)，4 ℃搖床中孵育過夜，二抗在室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗滌后滴加ECL發(fā)光液，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光顯影，采用Image Lab 3.0軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，計算TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK相對表達(dá)，以β-actin為參照蛋白。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方紅景參丸對大鼠一般狀態(tài)的影響 空白對照組大鼠攝食量、體質(zhì)量不斷增加，無咳嗽，呼吸平靜無喘鳴；模型對照組大鼠死亡1只，攝食量、體質(zhì)量增加不明顯，少數(shù)甚至減輕，呼吸急促，有咳嗽和喘鳴，活動明顯減少；氨茶堿組、復(fù)方紅景參丸各劑量組大鼠呼吸頻率較模型對照組有不同程度的降低，咳嗽、喘鳴減少，狀態(tài)較活躍，攝食量、體質(zhì)量均有不同程度的增加。

3.2 復(fù)方紅景參丸對大鼠肺功能的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均降低(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿組、復(fù)方紅景參丸各劑量組大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均升高(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠肺功能Tab.1 Pulmonary functions of rats in each

3.3 復(fù)方紅景參丸對大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)及分類的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)均升高(P<0.05)；與模型對照組比較，氨茶堿組及復(fù)方紅景參丸高劑量組大鼠白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)均降低(P<0.01)，復(fù)方紅景參丸中劑量組白細(xì)胞總數(shù)及淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)，巨噬細(xì)胞無明顯變化(P>0.05)，復(fù)方紅景參丸低劑量組中性粒細(xì)胞數(shù)下降(P<0.05)，白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液白細(xì)胞計數(shù)及分類Tab.2 Counts and classification of white blood cells in bronchoalveolar lavage fluid of rats in each group

3.4 復(fù)方紅景參丸對大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響 空白對照組大鼠支氣管壁結(jié)構(gòu)完整，肺泡形態(tài)正常，無明顯的炎性浸潤和腺體增生；模型對照組大鼠支氣管壁附著有大量炎性細(xì)胞，部分肺泡相互融合增大，肺泡管、細(xì)支氣管擴(kuò)張成大型腔狀結(jié)構(gòu)，有明顯腺體增生；氨茶堿組與復(fù)方紅景參丸各劑量組大鼠支氣管有少量炎性細(xì)胞附著，并隨著劑量升，炎性細(xì)胞附著數(shù)量減少，肺泡間隔破壞程度減輕，見圖1。

3.5 復(fù)方紅景參丸對大鼠血清炎性因子的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿組與復(fù)方紅景參丸各劑量組大鼠LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平低(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平Tab.3 Serum levels of LTB4,IL-6,IL-1β and TNF-α in rats in each group

3.6 復(fù)方紅景參丸對大鼠肺組織TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、p-p38MAPK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型對照組比較，氨茶堿組及復(fù)方紅景參丸各劑量組TNF-α、p-p38MAPK蛋白表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)；各組大鼠肺組織p38MAPK蛋白表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

4 討論

注：黃色箭頭表示肺泡相互融合增大，部分肺泡管、細(xì)支氣管擴(kuò)張成大型腔狀結(jié)構(gòu)。圖1 各組大鼠肺組織形態(tài) (HE，×200)Fig.1 Lung tissue morphologies of rats in each group (HE，×200)

慢性阻塞性肺疾病是一種常見的、可以預(yù)防和治療的疾病，以進(jìn)行性的氣流受限為特征，通常是漸進(jìn)性的，與氣道內(nèi)增強(qiáng)的慢性炎癥以及肺部對有害顆?；驓怏w的反應(yīng)有關(guān)[8]。COPD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以氣道炎癥為核心，涉及到氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、衰老、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、鐵離子代謝和基因多態(tài)性等[9-10]。COPD盡管研究廣泛，但在分子水平上對其潛在機(jī)制仍知之甚少，因此目前尚無有效治療藥物，指南推薦穩(wěn)定期患者吸入長效支氣管擴(kuò)張劑輔以中藥維持治療[11]。吸煙是導(dǎo)致COPD病發(fā)最主要的危險因素，因為香煙煙霧包含尼古丁、焦油、氨、CO等有毒物質(zhì)，人體吸入后可引起氣道炎癥，呼吸道黏液大量分泌[12]。通常采用煙霧暴露聯(lián)合氣道滴入LPS的方法造模，該方法也是目前最為常用的COPD動物模型，能較為真實地模擬人類COPD的發(fā)病過程[13]。本研究中采用FVC、FEV1觀察通氣功能，通過PEF反映出氣流受限程度，大鼠呼吸頻率較人類快，故本研究用FEV0.1替代FEV1[14]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠呼吸頻率加快、喘鳴、打噴嚏等癥狀，肺功能指標(biāo)FVC、FEV0.1、PEF水平較空白對照組均降低，HE染色發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠支氣管出現(xiàn)炎性浸潤，腺體顯著增生，這些結(jié)果均表明COPD大鼠模型成功建立。COPD模型大鼠在給予氨茶堿、復(fù)方紅景參丸干預(yù)后，肺組織慢性炎癥病理變化明顯減輕，F(xiàn)VC、FEV0.1、PEF水平趨于正常，肺泡灌洗液白細(xì)胞總數(shù)及分類不同程度減輕，揭示復(fù)方紅景參丸對COPD大鼠有較好的治療作用。氨茶堿為茶堿與乙二胺復(fù)鹽，能使支氣管平滑肌松弛，且在COPD時可增強(qiáng)膈肌收縮力，有益于改善呼吸功能，目前是臨床用于治療COPD的常用藥物[15]。復(fù)方紅景參丸高劑量組與氨茶堿組療效接近，說明復(fù)方紅景參丸對慢性阻塞性肺炎具有良好的療效，不僅能改善COPD的癥狀，也能改善FVC、FEV0.1、PEF等肺功能指標(biāo)。

注：A為蛋白條帶圖，B為蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計圖。與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組大鼠肺組織TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of TNF-α,p38MAPK and p-p38MAPK proteins in rat lung tissues in each group

近年研究發(fā)現(xiàn)，COPD肺內(nèi)炎癥細(xì)胞以肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞為主，激活的炎癥細(xì)胞釋放多種炎性介質(zhì)，包括LTB4、IL-8、TNF-α等，這些炎性介質(zhì)能夠破壞肺的結(jié)構(gòu)及促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)[16-19]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清炎癥因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿與復(fù)方紅景參丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，證實復(fù)方紅景參丸治療COPD可能與下調(diào)血清炎性因子的水平從而減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶的亞類之一，屬應(yīng)激激活的蛋白激酶，p38MAPK是控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，LPS、TNF等炎癥刺激，能誘導(dǎo)內(nèi)源性免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞內(nèi)的p38激活[20]。炎癥反應(yīng)時血液中的白細(xì)胞從血管中游出，浸潤到炎癥部位，需要經(jīng)過附壁、黏著、游出和趨化作用等階段，這些都與p38 MAPK的激活緊密相關(guān)[21]。p38 MAPK的激活不僅能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL6、IL-1β等炎性因子，還可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化[22]。中性粒細(xì)胞炎性聚集很大程度上依賴 p38 MAPK的激活，GM2CGF、TNF2α可明顯增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)作用[23]。抑制p38MAPK通路可減少促炎因子表達(dá)，使炎癥反應(yīng)得以緩解，有助于改善患者肺功能。本研究Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組大鼠肺組織p38MAPK表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，但慢性阻塞性肺炎模型大鼠肺組織p-p38MAPK、TNF-α表達(dá)升高，說明COPD的發(fā)生與肺組織p38MAPK通路受到激活有關(guān)。復(fù)方紅景參丸干預(yù)后p-p38MAPK、TNF-α的蛋白表達(dá)較模型對照組降低，結(jié)合復(fù)方紅景參丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，提示復(fù)方紅景參丸可通過抑制p38MAPK的磷酸化激活，進(jìn)一步下調(diào)炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)，從而修復(fù)COPD模型大鼠肺組織損傷。