黃莉容，張馨月，曾 銳，劉明華，孫 琴*

(1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，2017新版慢性阻塞性肺病全球倡議，將COPD定義為一種常見的以氣流受限和持續(xù)性呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的，可以預防和治療的肺部疾病[1-2]。COPD實質是一種慢性氣道炎癥性疾病，炎癥細胞浸潤刺激大量的炎性因子釋放，引起黏液分泌增加，同時出現(xiàn)免疫功能異常，尤其是免疫細胞功能紊亂[3]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)為應激蛋白激酶，幾乎參與生物體內(nèi)全部的病理、生理過程，特別是氧化應激、炎性反應等，磷酸化的p38MAPK可激活大量轉錄因子，促進炎性因子等多種基因的表達[4-6]。復方紅景參丸為治療慢性阻塞性肺病的臨床經(jīng)驗方，君藥為紅景天、人參；臣藥有麥冬、金釵石斛；佐以丹參制成中藥丸劑，具有益氣活血，健脾潤肺的功效，適用于缺氧亞健康人群。本研究采用煙熏和氣道滴入脂多糖(LPS)構建慢性阻塞性肺炎模型大鼠，研究復方紅景參丸對COPD模型大鼠肺功能、炎性因子及p38MAPK通路的影響，旨在將復方紅景參丸開發(fā)為醫(yī)療機構制劑，并為臨床用于COPD提供科學的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 復方紅景參丸(工藝路線為紅景天、麥冬和石斛水提，人參、丹參打粉)為棕褐色濃縮丸，氣微，味微苦，每1 g含紅景天苷(C14H20O7)不得少于1.28 mg，含人參皂苷Rg1、Re、Rb1總量不得少于2.02 mg，由西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備，大鼠給藥劑量按生藥量計算。氨茶堿片(國藥集團汕頭金石制藥有限公司，批號H19021214，規(guī)格0.1 g)。白三烯(LTB4)、白細胞介素-6 (IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)酶聯(lián)免疫吸法ELISA試劑盒及蘇木精-伊紅(HE)染色液，均購自上海碧云天生物技術有限公司；中華牌香煙(上海煙草集團有限責任公司，含焦油10 mg、尼古丁1.0 mg、煙氣一氧化碳量13 mg)；組織蛋白提取試劑，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；一抗兔抗鼠TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體，購自美國CST公司；二抗辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，購自北京中山生物技術有限公司。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，4～5周齡，雌雄各半，體質量180～220 g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，實驗動物使用許可證號SYXK(川)2018-24，飼養(yǎng)于SPF級動物室中，相對濕度為40%～70%，溫度為20～25 ℃，換氣次數(shù)為10～12次/h,保持12 h/12 h光照循環(huán)，自由攝食飲水。

2 方法

2.1 模型建立 60只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、模型對照組、氨茶堿組及復方紅景參丸低、中、高劑量組，每組10只，空白對照組大鼠正常飼養(yǎng)，其余50只通過煙熏和LPS氣道滴入法建立COPD模型，每天煙霧暴露2次，每次30 min，煙熏箱規(guī)格為60 cm×40 cm×30 cm，每次點燃15支中華香煙，連續(xù)處理28 d；于實驗起第1、14天，10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，向氣管內(nèi)注入1 mg/kg LPS[6]。在第2次注射LPS后開始，復方紅景參丸低、中、高劑量組每天分別灌胃給予1.17、2.33、3.5 g生藥/kg，氨茶堿組灌胃給予160 mg/kg氨茶堿，空白對照組和模型對照組灌胃給予等容量生理鹽水，每天1次，連續(xù)4周。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察 觀察并記錄各組大鼠體質量、呼吸有無咳嗽、氣急、喘鳴等情況，攝食量、毛發(fā)及其他異常變化。

2.3 大鼠肺功能指標檢測 大鼠灌胃給藥4周后，腹腔注射10%水合氯醛2 mL/kg麻醉，暴露氣管后切開，插入連接有三通管的插管，其另一端與FlexiVent動物肺功能儀相連，待大鼠蘇醒后檢測用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)、第0.1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV0.1)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)[7]。

2.4 大鼠肺泡灌洗液白細胞計數(shù)及分類 大鼠腹主動脈采血后撤走三通管，打開胸腔暴露肺臟，將右肺門用手術線結扎，左肺通過插管緩慢注入5 mL生理鹽水，洗滌3次，洗滌液離心棄上清，200 μL PBS重懸沉淀，取20 μL懸液，在顯微鏡下統(tǒng)計白細胞總數(shù)。將剩余懸液制成細胞涂片，進行瑞氏-吉姆染色，在顯微鏡下統(tǒng)計200個細胞中肺泡巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞的數(shù)目。

2.5 HE染色 剪取右肺，PBS洗滌后10%中性甲醛固定，脫水，石蠟包埋，HE染色，封片，在光鏡下觀察，進行組織病理學檢測。

2.6 大鼠炎性因子水平檢測 肺功能測定完成后，大鼠腹主動脈采血，收集的血液室溫放置4 h后離心，取上層血清置于-20 ℃?zhèn)溆?。臨用前平衡至室溫，按照ELISA試劑盒說明書步驟進行操作，檢測血清炎性指標LTB4、IL-6、IL-1、TNF-α的水平。

2.7 Western blot分析 肺功能測定完成后，剪下大鼠前葉肺組織，在液氮下凍存?zhèn)溆?，實驗時取出，加入RIPA裂解液充分研磨后勻漿，提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，上樣量為50 μg，在80～120 V下進行SDS-聚丙烯凝膠膠電泳，100 V下進行轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌后加1∶1 000稀釋的一抗(TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK)，4 ℃搖床中孵育過夜，二抗在室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗滌后滴加ECL發(fā)光液，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)曝光顯影，采用Image Lab 3.0軟件對蛋白條帶進行分析，計算TNF-ɑ、p38MAPK、p-p38MAPK相對表達，以β-actin為參照蛋白。

3 結果

3.1 復方紅景參丸對大鼠一般狀態(tài)的影響 空白對照組大鼠攝食量、體質量不斷增加，無咳嗽，呼吸平靜無喘鳴；模型對照組大鼠死亡1只，攝食量、體質量增加不明顯，少數(shù)甚至減輕，呼吸急促，有咳嗽和喘鳴，活動明顯減少；氨茶堿組、復方紅景參丸各劑量組大鼠呼吸頻率較模型對照組有不同程度的降低，咳嗽、喘鳴減少，狀態(tài)較活躍，攝食量、體質量均有不同程度的增加。

3.2 復方紅景參丸對大鼠肺功能的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均降低(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿組、復方紅景參丸各劑量組大鼠FVC、FEV0.1、PEF水平均升高(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠肺功能Tab.1 Pulmonary functions of rats in each

3.3 復方紅景參丸對大鼠肺泡灌洗液白細胞總數(shù)及分類的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠白細胞總數(shù)及巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)均升高(P<0.05)；與模型對照組比較，氨茶堿組及復方紅景參丸高劑量組大鼠白細胞總數(shù)及巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)均降低(P<0.01)，復方紅景參丸中劑量組白細胞總數(shù)及淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)降低(P<0.05，P<0.01)，巨噬細胞無明顯變化(P>0.05)，復方紅景參丸低劑量組中性粒細胞數(shù)下降(P<0.05)，白細胞總數(shù)及巨噬細胞、淋巴細胞數(shù)無明顯變化(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液白細胞計數(shù)及分類Tab.2 Counts and classification of white blood cells in bronchoalveolar lavage fluid of rats in each group

3.4 復方紅景參丸對大鼠肺組織形態(tài)學的影響 空白對照組大鼠支氣管壁結構完整，肺泡形態(tài)正常，無明顯的炎性浸潤和腺體增生；模型對照組大鼠支氣管壁附著有大量炎性細胞，部分肺泡相互融合增大，肺泡管、細支氣管擴張成大型腔狀結構，有明顯腺體增生；氨茶堿組與復方紅景參丸各劑量組大鼠支氣管有少量炎性細胞附著，并隨著劑量升，炎性細胞附著數(shù)量減少，肺泡間隔破壞程度減輕，見圖1。

3.5 復方紅景參丸對大鼠血清炎性因子的影響 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿組與復方紅景參丸各劑量組大鼠LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平低(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠血清LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平Tab.3 Serum levels of LTB4,IL-6,IL-1β and TNF-α in rats in each group

3.6 復方紅景參丸對大鼠肺組織TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達的影響 與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、p-p38MAPK蛋白表達升高(P<0.05)；與模型對照組比較，氨茶堿組及復方紅景參丸各劑量組TNF-α、p-p38MAPK蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)；各組大鼠肺組織p38MAPK蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

4 討論

注：黃色箭頭表示肺泡相互融合增大，部分肺泡管、細支氣管擴張成大型腔狀結構。圖1 各組大鼠肺組織形態(tài) (HE，×200)Fig.1 Lung tissue morphologies of rats in each group (HE，×200)

慢性阻塞性肺疾病是一種常見的、可以預防和治療的疾病，以進行性的氣流受限為特征，通常是漸進性的，與氣道內(nèi)增強的慢性炎癥以及肺部對有害顆粒或氣體的反應有關[8]。COPD的發(fā)病機制復雜，以氣道炎癥為核心，涉及到氧化應激、線粒體功能障礙、衰老、上皮-間充質轉化、鐵離子代謝和基因多態(tài)性等[9-10]。COPD盡管研究廣泛，但在分子水平上對其潛在機制仍知之甚少，因此目前尚無有效治療藥物，指南推薦穩(wěn)定期患者吸入長效支氣管擴張劑輔以中藥維持治療[11]。吸煙是導致COPD病發(fā)最主要的危險因素，因為香煙煙霧包含尼古丁、焦油、氨、CO等有毒物質，人體吸入后可引起氣道炎癥，呼吸道黏液大量分泌[12]。通常采用煙霧暴露聯(lián)合氣道滴入LPS的方法造模，該方法也是目前最為常用的COPD動物模型，能較為真實地模擬人類COPD的發(fā)病過程[13]。本研究中采用FVC、FEV1觀察通氣功能，通過PEF反映出氣流受限程度，大鼠呼吸頻率較人類快，故本研究用FEV0.1替代FEV1[14]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠呼吸頻率加快、喘鳴、打噴嚏等癥狀，肺功能指標FVC、FEV0.1、PEF水平較空白對照組均降低，HE染色發(fā)現(xiàn)模型對照組大鼠支氣管出現(xiàn)炎性浸潤，腺體顯著增生，這些結果均表明COPD大鼠模型成功建立。COPD模型大鼠在給予氨茶堿、復方紅景參丸干預后，肺組織慢性炎癥病理變化明顯減輕，F(xiàn)VC、FEV0.1、PEF水平趨于正常，肺泡灌洗液白細胞總數(shù)及分類不同程度減輕，揭示復方紅景參丸對COPD大鼠有較好的治療作用。氨茶堿為茶堿與乙二胺復鹽，能使支氣管平滑肌松弛，且在COPD時可增強膈肌收縮力，有益于改善呼吸功能，目前是臨床用于治療COPD的常用藥物[15]。復方紅景參丸高劑量組與氨茶堿組療效接近，說明復方紅景參丸對慢性阻塞性肺炎具有良好的療效，不僅能改善COPD的癥狀，也能改善FVC、FEV0.1、PEF等肺功能指標。

注：A為蛋白條帶圖，B為蛋白相對表達量統(tǒng)計圖。與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 各組大鼠肺組織TNF-α、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達Fig.2 Expressions of TNF-α,p38MAPK and p-p38MAPK proteins in rat lung tissues in each group

近年研究發(fā)現(xiàn)，COPD肺內(nèi)炎癥細胞以肺泡巨噬細胞、中性粒細胞和CD8 T細胞為主，激活的炎癥細胞釋放多種炎性介質，包括LTB4、IL-8、TNF-α等，這些炎性介質能夠破壞肺的結構及促進中性粒細胞炎癥反應[16-19]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清炎癥因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.01)；與模型對照組比較，氨茶堿與復方紅景參丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，證實復方紅景參丸治療COPD可能與下調(diào)血清炎性因子的水平從而減輕炎癥反應相關。

p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶的亞類之一，屬應激激活的蛋白激酶，p38MAPK是控制炎癥反應最重要的成員，LPS、TNF等炎癥刺激，能誘導內(nèi)源性免疫細胞如單核細胞、內(nèi)皮細胞和中性粒細胞內(nèi)的p38激活[20]。炎癥反應時血液中的白細胞從血管中游出，浸潤到炎癥部位，需要經(jīng)過附壁、黏著、游出和趨化作用等階段，這些都與p38 MAPK的激活緊密相關[21]。p38 MAPK的激活不僅能促進單核巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL6、IL-1β等炎性因子，還可介導中性粒細胞的活化[22]。中性粒細胞炎性聚集很大程度上依賴 p38 MAPK的激活，GM2CGF、TNF2α可明顯增強中性粒細胞的呼吸爆發(fā)作用[23]。抑制p38MAPK通路可減少促炎因子表達，使炎癥反應得以緩解，有助于改善患者肺功能。本研究Western blot結果發(fā)現(xiàn)各組大鼠肺組織p38MAPK表達無顯著差異(P>0.05)，但慢性阻塞性肺炎模型大鼠肺組織p-p38MAPK、TNF-α表達升高，說明COPD的發(fā)生與肺組織p38MAPK通路受到激活有關。復方紅景參丸干預后p-p38MAPK、TNF-α的蛋白表達較模型對照組降低，結合復方紅景參丸降低COPD模型大鼠血清炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，提示復方紅景參丸可通過抑制p38MAPK的磷酸化激活，進一步下調(diào)炎性因子LTB4、IL-6、IL-1β、TNF-α的表達，從而修復COPD模型大鼠肺組織損傷。