平大冰，孫 鑫，彭 淵，胡旭東，陶艷艷，劉成海,3*

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生物教研室，上海 201203；3.上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203)

自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells)是先天免疫系統(tǒng)重要的免疫細胞，是人體抵抗癌細胞和病毒感染的第一道防線，充當免疫反應的調(diào)節(jié)劑[1]。NK細胞具有很強的免疫調(diào)節(jié)功能，可以通過直接殺傷肝星狀細胞而具有抗纖維化活性[2]。扶正化瘀方(制劑為膠囊或片劑)由丹參、桃仁、蟲草菌絲、松黃、五味子、絞股藍組成，是上海中醫(yī)藥大學肝病研究所研制的抗肝纖維化中藥新藥(Z20020073)，目前廣泛應用于臨床治療肝纖維化和肝硬化，研究發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)機體免疫微環(huán)境發(fā)揮抗肝纖維化作用[3]，但其對NK細胞的影響尚不明確。本研究擬通過人外周血NK細胞系NK92細胞，探討扶正化瘀方對NK細胞的活化和殺傷功能影響，為進一步研究扶正化瘀方對機體免疫微環(huán)境調(diào)節(jié)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 人外周血NK細胞NK92(ATCC?CRL-2407TM)，懸浮生長，購自美國ATCC細胞庫。NK92細胞在Tank細胞無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人慢性髓系白血病細胞K562(3131C0001000700029)，懸浮生長，在自然殺傷分析中廣泛作為高敏感的體外受體，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，K562細胞在含有10%FBS的IMDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞均培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2環(huán)境中。

1.2 藥物 聚肌胞苷酸(Poly I:C，貨號P9582)，購自美國Sigma公司，批號118M4035V。扶正化瘀方浸膏粉，批號180206，由上海黃海制藥有限責任公司提供，每24 g全方中丹參以丹酚酸B計不低于15.6 mg/批，以丹參素鈉計不低于13.2 mg/批，蟲草菌絲以腺苷計不少于4.8 mg/批，五味子以五味子乙素計不少于2.28 mg/批。

2 方法

2.1 給藥 將扶正化瘀方浸膏粉溶于DMSO(美國Sigma公司，批號0231)中，制成100 mg/mL貯備液，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度。首先，以不同質(zhì)量濃度(0～400 μg/mL)扶正化瘀方孵育細胞24 h以評估該方對NK92細胞的活力影響，確定最大無毒質(zhì)量濃度，然后在無毒劑量范圍予不同質(zhì)量濃度(不少于3個)該方以觀察它對NK92細胞功能的影響。Poly I:C粉末首先溶于無菌PBS中，制成10 mg/mL貯備液，給藥時以培養(yǎng)基稀釋成100 μg/mL，作為陽性對照藥組[4]。

2.2 細胞活性檢測 采用Cell Counting Kit-8(上海碧云天生物技術有限公司，批號40203ES60)試劑盒檢測細胞活性，具體操作根據(jù)說明書進行。

2.3 Annexin V/7-AAD復染法檢測細胞凋亡 NK92細胞種板后藥物孵育8 h，收集細胞，Annexin V PE/7-AAD孵育染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡，以陰性對照管調(diào)節(jié)電壓，單染管調(diào)節(jié)熒光補償，F(xiàn)lowJo V10.0軟件分析早期凋亡(Annexin V+7-AAD-)和晚期凋亡(Annexin V+7-AAD+)的細胞占比。

2.4 熒光定量PCR檢測mRNA表達 采用總RNA抽提試劑盒(批號B511321)提取NK92細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimescriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(批號RR047A)將其逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，TBGreenTMPremix EX TaqTM擴增試劑盒(批號RR420A)進行PCR擴增，以上試劑均購自日本TaKaRa公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體見表1。

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

2.5 流式細胞術檢測細胞表面分子 NK92細胞種板后加藥物孵育，收集細胞進行流式孵育染色。使用FITC anti-human CD314(NKG2D，Clone：1D11，批號320820)、APC anti-human CD337(NKp30，批號325210)、Alexa Fluor?700 Anti-Human CD335(NKp46，批號331932)對細胞進行表面分子觀察，以上抗體均購自美國BioLegend公司，再使用Flowjo V10.0軟件進行分析。

2.6 ELISA檢測細胞因子分泌水平 NK92細胞種板后加藥物孵育，收集細胞上清，采用Human Interferon γ ELISA Kit(人γ干擾素ELISA試劑盒，批號EK0373)、Human Granzyme B ELISA Kit(人顆粒酶B ELISA試劑盒，批號EK1114)檢測上清中細胞因子水平。

2.7 NK92細胞與CFSE-K562細胞共培養(yǎng)殺傷體系建立 NK92細胞種板后藥物孵育8 h，設空白對照組和Poly I:C陽性對照組，制備5 μmol/L CFSE工作液，與K562細胞預孵育20 min染色標記。收集孵育后NK92細胞，按照4∶1比例與K562細胞共培養(yǎng)4 h后7-AAD+染色，流式細胞術在CFSE(FITC)陽性信號門內(nèi)觀察7-AAD+染色細胞比例。

3 結(jié)果

3.1 扶正化瘀方對NK92細胞的毒性 扶正化瘀方質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL時，對NK92細胞活性無明顯損傷；在200 μg/mL時，細胞存活率開始下降；在400 μg/mL時，NK92細胞活性受到明顯抑制，即最大無毒劑量為100 μg/mL，見圖1。

圖1 扶正化瘀方對NK92細胞的毒性Fig.1 Cytotoxicity of Fuzheng Huayu Decoction on NK92 cells

3.2 扶正化瘀方對NK92細胞凋亡的影響 扶正化瘀方質(zhì)量濃度在0.1～10 μg/mL時，能降低NK92細胞早期、晚期凋亡率(P<0.05)；在100 μg/mL時，僅對晚期凋亡率有抑制作用(P<0.05)，見圖2。

注：與空白對照組(0 μg/mL)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 扶正化瘀方NK92細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Fuzheng Huayu Decoction on the apoptosis of NK92

3.3 扶正化瘀對NK92細胞表面激活型受體mRNA表達的影響 扶正化瘀方質(zhì)量濃度在100 μg/mL時，可上調(diào)NK細胞表面激活型受體NKG2D、NKp30、NKp46 mRNA表達(P<0.05)，并且在低質(zhì)量濃度時對NKG2D、NKp46 mRNA表達也有一定的促進作用，見圖3；在12.5～100 μg/mL時，均可不同程度增加NK92細胞表面激活型受體NKG2D、NKp30、NKp46表達，其中100 μg/mL下對NKG2D的促進作用更明顯，見圖4。

注：與空白對照組(0 μg/mL)比較，*P<0.05。圖3 扶正化瘀方對NK92細胞NKG2D、NKp30、NKp46 mRNA表達的影響Fig.3 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on mRNA expressions of NKG2D,NKp30 and NKp46 of NK92

3.4 扶正化瘀方對NK92細胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影響 扶正化瘀方質(zhì)量濃度在12.5～50 μg/mL時，可明顯促進NK92細胞分泌IFN-γ因子(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性；在0 μg/mL時，還可促進NK92細胞分泌Granzyme B(P<0.05)，見圖5。

3.5 扶正化瘀方對NK92細胞殺傷K562細胞功能的影響 與CFSE-K562細胞對照組比較，NK92細胞可促進K562細胞的凋亡(P<0.01)，提示共培養(yǎng)殺傷體系建立成功；與共培養(yǎng)對照組比較，Poly I:C陽性對照組可促進NK92細胞殺傷K562細胞的能力，促進K562細胞凋亡(P<0.01)；扶正化瘀方質(zhì)量濃度在25～100 μg/mL時，均可提高NK92細胞殺傷K562細胞的作用(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖6。

注：與空白對照組(0 μg/mL)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 扶正化瘀方對NK92細胞表面激活型受體表達的影響Fig.4 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on activated surface receptor expression of NK92

注：與空白對照組(0 μg/mL)比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 扶正化瘀方對NK92細胞分泌IFN-γ、Granzyme B水平的影響Fig.5 Effects of Fuzheng Huayu Decoction on the levels of IFN-γ and Granzyme B secreted by NK92

注：與CFSE-K562對照組比較，**P<0.01；與CFSE-K562+NK92對照組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖6 扶正化瘀方對NK92細胞殺傷K562細胞功能的影響Fig.6 Effect of Fuzheng Huayu Decoction on NK92 cells-induced cytotoxicity to K562

4 討論

扶正化瘀方由丹參、桃仁、蟲草菌絲、松黃、五味子和絞股藍組成，臨床試驗發(fā)現(xiàn)其對阻止肝纖維化的發(fā)展具有良好作用趨勢[5]，目前成為臨床上治療肝纖維化和肝硬化的常用藥物[6]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方發(fā)揮抗肝纖維化作用可能與其對機體免疫調(diào)節(jié)有關，其可以通過抑制MAPK信號通路抑制M1型巨噬細胞極化，發(fā)揮抗炎、抗肝纖維化作用[7]。自然殺傷(NK)細胞是機體免疫環(huán)境重要的免疫細胞，屬于天然免疫系統(tǒng)的核心細胞，在體內(nèi)負責殺傷老化細胞，發(fā)揮抗感染、抗腫瘤等重要作用，與慢性肝炎、酒精性/非酒精性脂肪性肝炎、肝細胞癌等肝臟疾病關系密切[8]。近年來，NK細胞可以殺傷活化肝星狀細胞的研究也已經(jīng)被證實[9-10]。

NK92細胞株是來源于人惡性非霍奇金淋巴瘤外周血的永生化NK細胞系，目前被廣泛應用于研究藥物對NK細胞功能的影響[11-12]。NK細胞識別自我與非我過程通過表達多種受體執(zhí)行功能，其中包括C型凝集素家族如NKG2D受體[13]，天然細胞毒性受體(NCR)如NKp30、NKp44和NKp46受體[10]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在扶正化瘀方對NK92細胞的最大無毒質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，扶正化瘀方在低質(zhì)量濃度時可以有效保護NK92細胞的自發(fā)凋亡。不同劑量扶正化瘀方作用于NK92細胞后，可以不同程度的提高其表面激活型受體NKG2D、NKp30和NKp46在轉(zhuǎn)錄水平的表達；流式細胞術分析結(jié)果也觀察到扶正化瘀方對NKG2D、NKp44和NKp46受體有上調(diào)作用。NK細胞發(fā)揮對靶細胞的殺傷作用，除了表面激活型受體的活化外，還可以通過受體-配體結(jié)合方式，誘導NK細胞分泌大量如IFN-γ、穿孔素和顆粒酶等細胞因子，發(fā)揮殺傷作用[11]。因此，本研究也觀察了扶正化瘀方對NK92細胞分泌細胞毒性分子的影響，發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方可以增強NK92細胞分泌IFN-γ和顆粒酶B的能力。

由于NK92細胞不表達CD16分子，因此沒有抗體依賴性介導的細胞毒效應，可以非特異性直接殺傷靶細胞[14]。于是本研究觀察了扶正化瘀方對NK92細胞殺傷作用的影響，以目前比較公認的聚肌胞苷酸(Poly I:C)NK細胞激動劑作為陽性對照藥[15]。實驗結(jié)果顯示不同質(zhì)量濃度扶正化瘀方可以明顯增強NK92細胞對靶細胞K562的殺傷作用，且呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度梯度依賴性。

綜上所述，扶正化瘀方可以促進NK92細胞活化并增強其殺傷靶細胞功能，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)肝臟區(qū)域免疫微環(huán)境的作用。