郭勝男，張 莉，吳深濤，劉弘毅

(1.山東大學第二醫(yī)院，山東 濟南 250000；2.天津河東盛世眾康醫(yī)院，天津 300171；3.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300380；4.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟估計，到2045年，全球糖尿病的患病人數(shù)將從2017年的4.25億增加到6.29億[1]。2型糖尿病更為普遍，約占糖尿病患者的90%，主要是由胰島素抵抗和代償性胰島素分泌不足引起[2-3]。導致胰島素抵抗和2型糖尿病的危險因素很多，不可改變的危險因素有家族病史、年齡(>45歲)等；可改變的危險因素有肥胖、高血脂、高血壓等。但是，這些傳統(tǒng)的常規(guī)危險因素不能完全解釋全世界范圍內(nèi)2型糖尿病患者人數(shù)的迅猛增加，但其與全球城市化和工業(yè)化進程相一致[4]。

持續(xù)性有機污染物是全球工業(yè)化發(fā)展帶來的環(huán)境污染物，是污染物中最具代表性的有毒化學物質(zhì)[5]，可通過食物鏈在人體中(例如血液、脂肪、肝臟、母乳等)積累，對人體健康構(gòu)成巨大威脅[6]。德國哈勒和奧格斯堡兩項隊列研究證實，持續(xù)性有機污染物具有在一般人群中致胰島素抵抗及糖尿病的影響[7]。

先前的動物研究結(jié)果表明，吳深濤教授的經(jīng)驗方——化濁解毒方能夠顯著改善二惡英及多氯聯(lián)苯標準品暴露的ZDF大鼠糖毒性、脂毒性及由其引起的胰島素抵抗[8-9]，但具體分子生物學機制目前尚不明確。本課題選用了1種具有代表性且毒性較強的持續(xù)性有機污染物——PCB126，建立ZDF大鼠染毒模型，探究化濁解毒方改善染毒大鼠脂肪組織胰島素抵抗的分子生物學機制，為未來抗糖尿病藥物的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物及飼料 選用SPF級健康雄性 ZDF(fa/fa)大鼠作為模型對照，體質(zhì)量180～200 g；選擇SPF級雄性ZDF(fa/+)大鼠作為正常對照，體質(zhì)量140～160 g，均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0006。PMILabdiet5008飼料配比為粗蛋白24%，粗脂肪7.1%，粗纖維3.2%，無氮浸出物48.9%，礦物質(zhì)(有機物)6.7%，維生素3.2%，購自雍立(上海)生物科技有限公司。

1.2 藥物 多氯聯(lián)苯126(3,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，PCB126)，CAS號57465-28-8，分子式C12H5CI5，購自北京曼哈格生物技術(shù)有限公司；CH223191(CAS號301326-22-7，分子式C19H19N5O)，購自美國Selleck Chemicals公司。化濁解毒方顆粒(組方藥材黃連、大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶、枳實、清半夏、白芍、柴胡、黃芩、干姜、佩蘭)，由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥廠制備，批號津藥制字(臨)Z20130944。

1.3 試劑與儀器

1.3.1 試劑 碘[125I]胰島素放射免疫試劑盒，購自北京北方生物技術(shù)研究所；游離脂肪酸測定試劑盒(比色法)，購自南京建成生物工程研究所；甘油三酯試劑盒(酶比色法)、膽固醇試劑盒(酶比色法)，均購自北京中生北控生物科技股份有限公司；一抗AhR(貨號ER62618)，購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；PPARγ、CD36、GLUT4、FGF21和、TNFα抗體(貨號分別為ab272718、ab252923、ab33780、ab171941、ab66579)、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(批號分別為201111、201112)，均購自英國Abcam公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號G1003)，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；中性樹膠(批號ZLI-9555)，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒(貨號BD0028)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(貨號AP0060)，均購自美國Bioworld Technology公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液5×(貨號P0015 L)，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔二抗(購自北京ANOLA，貨號AN19618A)。無水乙醇(批號100092683)、二甲苯(批號10023418)，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3.2 儀器 SN697雙探頭全自動放免γ計數(shù)器(上海核所日環(huán)光電儀器有限公司)；7020型ISE全自動生化分析儀(日本日立公司)；TDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；723S分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)；170-3940型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Trans-Blot型轉(zhuǎn)膜儀(美國Invitrogen公司)；Amersham imager 600型超靈敏多功能成像儀(美國General Electric公司)；RM2235病理切片機、ASP200S全自動脫水機、G1150H加熱石蠟包埋系統(tǒng)、DM3000正置光學顯微鏡(德國Leica公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析儀(美國Media Cybemetics公司)。

2 方法

2.1 分組與飼養(yǎng) 雄性ZDF(fa/fa)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)合格者隨機分為模型組與多氯聯(lián)苯染毒組，染毒8周，根據(jù)OGTT結(jié)果將多氯聯(lián)苯染毒組隨機分為染毒組、陽性藥組及化濁解毒方高、中、低劑量組，其間均以PMILabdiet5008專用飼料喂養(yǎng)，而雄性ZDF(fa/+)大鼠始終以普通飼料喂養(yǎng)。OGTT實驗方案為過夜禁食不禁水8 h以上，次日上午7：00，檢測大鼠空腹血糖、空腹體質(zhì)量，50%葡萄糖以2 g/kg劑量灌胃，于0、60、90、120 min進行血糖檢測，根據(jù)大鼠類型及前期預實驗結(jié)果，將糖耐量正常及已形成糖尿病者剔除，糖耐量受損者納入合格者范疇。

2.2 染毒及給藥 染毒組大鼠以每天250 ng/kg劑量灌胃給予PCB126染毒，模型組、正常組大鼠灌胃等量橄欖油，連續(xù)8周。依據(jù)《中國臨床藥理學與治療學》及課題組前期實驗結(jié)果，確定化濁解毒方高、中、低劑量分別為6.0、3.0、1.5 g/kg[10-11]，陽性藥組大鼠給予10 mg/kg CH223191灌胃治療，模型組、正常組大鼠以等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

2.3 取材及血清指標檢測 給藥結(jié)束后，大鼠過夜禁食不禁水8 h以上，次日腹腔注射麻醉后取材，腹主動脈取血后3 000 r/min離心15 min，收集血清，檢測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、空腹血清胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、甘油三酯(triglycerides，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)水平。對各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)進行計算[12]，公式為HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。切取大鼠附睪脂肪組織，生理鹽水清洗脂肪表面，置于4%多聚甲醛中固定，制作常規(guī)石蠟包埋進行后續(xù)實驗，剩余大鼠脂肪組織做好標記進行分裝，迅速將其置于干冰泡沫盒中冷凍，再迅速轉(zhuǎn)移放于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色觀察大鼠脂肪組織病理學變化 大鼠新鮮脂肪組織固定于4%多聚甲醛中24 h以上，常規(guī)乙醇梯度脫水，透明，石蠟包埋，切取4 μm，常規(guī)脫蠟，復水后進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組脂肪組織形態(tài)，采用圖像分析儀比較脂肪細胞平均大小。

2.5 Western blot檢測大鼠脂肪組織AhR、PPARγ及下游CD36、GLUT4、FGF21、TNFα蛋白表達 取凍存的大鼠脂肪組織適量，剪碎后放入離心管，根據(jù)相應(yīng)比例加入Western及IP細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑，超聲破碎儀冰上破碎組織，4 ℃、14 000 r/min離心5 min，分離上清液，即為總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，4%～12% SurePAGE蛋白預制膠上樣電泳分離蛋白，濃縮膠80 V電泳25 min，分離膠100 V電泳75 min，以PagePuler Prestained Protein Ladder所示的分子量切膠，甲醇浸泡PVDF膜，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入封閉液(5%進口脫脂奶粉)中，室溫搖床緩慢封閉2 h，TBST洗滌，分別加入AhR(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、CD36(1∶1 000)、GLUT4(1∶1 000)、FGF21(1∶1 000)、TNFα(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌5次，加入TBST稀釋的HRP 標記的二抗(1∶10 000)孵育1 h，再用TBST洗滌，按照顯影液說明書進行曝光。采用 Image J軟件，分析各目的蛋白/β-actin的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 化濁解毒方對大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組與陽性藥組大鼠上述指標均降低(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素及胰島素抵抗指數(shù)Tab.1 FBGs,FINSs and HOMA-IRs in rats in each

3.2 化濁解毒方對大鼠血脂水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠 TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組與陽性藥組大鼠TC、TG、FFA水平均降低(P<0.01)；化濁解毒方低劑量組大鼠TG水平雖有改善作用，但效果不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels in rats in each group n=10)

3.3 化濁解毒方對大鼠脂肪組織病理學形態(tài)的影響 正常組大鼠脂肪細胞排列緊密，細胞較小且大小均一；與正常組比較，模型組、染毒組大鼠脂肪細胞增大(P<0.01)，排列紊亂，以染毒組更顯著；與染毒組比較，化濁解毒方各劑量組及陽性藥組大鼠細胞縮小(P<0.01)，中、高劑量組及陽性藥組效果顯著，見圖1～2。

圖1 各組大鼠脂肪組織病理學形態(tài)(HE，×100)Fig.1 Pathological morphologies of adipose tissue in rats in each group (HE，×100)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01;與染毒組比較，ΔΔP<0.01。圖2 各組大鼠脂肪細胞大小Fig.2 Fat cell sizes of rats in each

注：A為正常組，B為模型組，C為染毒組，D為陽性藥組，E～G分別為化濁解毒方低、中、高劑量組。圖3 各組大鼠脂肪組織AhR/PPARs通路蛋白表達Fig.3 Expressions of AhR/PPARs pathway proteins in adipose tissue of rats in each group

3.4 化濁解毒方對大鼠脂肪組織AhR、CD36、TNFα蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達升高(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方中、高劑量組及陽性藥組大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖3、表3。

表3 各組大鼠脂肪組織AhR、CD36和TNF-α蛋白表達Tab.3 Expressions of AhR,CD36 and TNF-α proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

3.5 化濁解毒方對大鼠脂肪組織PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達降低(P<0.01)；與模型組比較，染毒組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達降低(P<0.01)；與染毒組比較，化濁解毒方中、高劑量給藥組及陽性藥組大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)，化濁解毒方低劑量組僅GLUT4蛋白表達升高(P<0.05)，PPAR-γ、FGF-21蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，見圖3、表4。

表4 各組大鼠脂肪組織PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白的表達Tab.4 Expressions of PPAR-γ,GLUT4 and FGF-21 proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

4 討論

芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)又名二惡英受體，是一種配體激活轉(zhuǎn)錄因子，主要在脂肪和肝臟中表達。研究發(fā)現(xiàn)，PCB126可特異性激活AhR影響糖脂代謝、激發(fā)炎癥進而導致胰島素抵抗[13-14]。白細胞分化抗原36 (cluster of differentiation 36,CD36)是一種高度糖基化的單鏈跨膜蛋白，能夠引起脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥[15-16]，是AhR下游的主要靶點[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，染毒組脂肪組織的AhR表達升高，與胰島素抵抗相關(guān)的糖脂代謝指標、炎癥因子TNFα及CD36的表達也升高，可能與PCB126激活AhR相關(guān)；與染毒組比較，化濁解毒方組AhR、TNFα、CD36及糖脂代謝指標表達下降，胰島素抵抗顯著改善，且中、高劑量組及陽性藥組效果顯著。陽性藥CH223191是在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)的一種效且特異性的AhR受體拮抗劑，能有效抑制PCB126介導的核易位和AhR與 DNA 結(jié)合[18-19]。因此，CH223191有效阻止了PCB126誘導的AhR基因的激活，改善胰島素抵抗，化濁解毒方顯示出同等的效果，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，說明化濁解毒方可能具有類“AhR受體拮抗劑”的作用。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)可促進機體從外周攝取葡萄糖，調(diào)節(jié)生物體糖穩(wěn)態(tài)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，GLUT4為AhR下游的靶點，AhR可通過抑制 GLUT4的表達與活性，誘發(fā)胰島素抵抗[21-22]。成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF21)具有改善胰島素抵抗及調(diào)節(jié)血脂的功能，受AhR的調(diào)控，主要在脂肪表達[23]。結(jié)果顯示，染毒組GLUT4與FGF21表達下調(diào)，說明兩者可能受到AhR的抑制。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)在維持能量平衡和抑制炎癥中發(fā)揮核心作用。PPARγ(主要在脂肪表達)是其中一個亞型，可增加脂質(zhì)在脂肪中的存儲，減輕脂質(zhì)在非脂肪組織的沉積，同時調(diào)節(jié)糖代謝和抑制炎癥。持續(xù)性有機污染物特異性激活 AhR 的多個下游重要靶點也受到 PPARs 調(diào)控。PPARs一方面受AhR的調(diào)控，另一方面可活化GLUT4，改善糖代謝，對CD36、TNF-α也有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ能刺激脂肪分泌 FGF-21 通過對抗糖脂毒性及增加脂肪的胰島素敏感性來改善胰島素抵抗；同時，F(xiàn)GF21還可刺激脂肪分泌具有胰島素增敏作用的脂聯(lián)素[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，染毒后，PPARγ及下游的GLUT4、FGF21均出現(xiàn)下調(diào)，一方面跟AhR的抑制相關(guān)，另一方面可能為PPARγ調(diào)控失衡；給藥后，3種蛋白均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，中、高劑量組效果顯著。前期實驗表明，化濁解毒方能通過調(diào)節(jié) PPARγ的表達改善胰島素抵抗[11]。本實驗進一步發(fā)現(xiàn)，化濁解毒方改善胰島素抵抗的機制可能是一方面抑制脂肪組織AhR及下游CD36與TNFα的表達；另一方面促進PPARγ及GLUT4與FGF21的表達。病理學研究發(fā)現(xiàn)，染毒組的脂肪細胞較模型組增大，給藥后，脂肪細胞減小。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞的大小與脂肪中TNFα表達呈正相關(guān)[25]。病理學結(jié)果說明，PCB126可加重脂肪的炎癥，經(jīng)化濁解毒方處理后，脂肪炎癥及胰島素抵抗得到改善。因此，化濁解毒方改善染毒大鼠脂肪胰島素抵抗的機制與其調(diào)控AhR/PPARs通路相關(guān)。