鄭 爽，何忠梅，宗 穎，時(shí) 坤,2，陳維佳*，杜 銳,2*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118)

痛風(fēng)是由于機(jī)體長期嘌呤代謝障礙，血尿酸水平增高，導(dǎo)致尿酸結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)及皮下組織，誘使炎癥細(xì)胞聚集發(fā)生吞噬反應(yīng)，吞噬細(xì)胞破裂釋放出多種致炎致痛因子，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的關(guān)節(jié)紅、腫、熱、痛及痛風(fēng)結(jié)石形成[1-4]，近年來發(fā)病率不斷上升，是最常見的關(guān)節(jié)炎形式之一[5-6]。目前，全世界對痛風(fēng)的治療效果不明顯[7]，臨床常用的非甾體抗炎藥、秋水仙堿等具有肝、腎、胃腸道毒性等諸多不良反應(yīng)[8]，故開發(fā)高效低毒的抗痛風(fēng)中藥新藥勢在必行[9]。

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomeniumacutum(Thunb.)Rehd.et Wils.、毛青藤Sinomeniumacutum(Thunb)Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤莖[10]，其主要成分青藤堿可通過抑制免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、保護(hù)軟骨等多種途徑來治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]。為推動中藥現(xiàn)代化，中藥藥代動力學(xué)成為近年來興起的新領(lǐng)域[12]，對青藤堿的相關(guān)研究已有不少報(bào)道，但尚未涉及該成分在急性痛風(fēng)大鼠體內(nèi)的排泄動力學(xué)。因此，本實(shí)驗(yàn)考察急性痛風(fēng)大鼠尿液、糞便、膽汁中青藤堿隨時(shí)間的排泄變化規(guī)律，以期為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；5810R型臺式高速離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；BSA224S型電子分析天平(德國賽多利斯公司)；DW-H型超低溫冷凍存儲箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；ZH-B6型代謝籠(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；MX-F型漩渦混勻器(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；LC-DCY-12G型干式氮吹儀(上海力辰邦西儀器科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 氧嗪酸鉀(純度≥99.7%，批號B22D9D78194)、黃嘌呤(純度≥98%，批號A11A9M58302)、尿酸鈉(純度≥98%，批號S16N8I46625)、烏來糖(純度≥98%，批號Z20J9Y64014)對照品(上海源葉生物有限公司)；鹽酸青藤堿對照品(純度≥98%，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號J0102A)；磷酸二氫鉀對照品(純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號J1811174)。三氯甲烷、異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈為色譜純(美國 Fisher公司)；水為娃哈哈純凈水。

1.3 動物 雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(吉)-2015-0005。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將大鼠分成正常組6只、模型組12只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。模型組大鼠連續(xù)7 d腹腔注射造模藥物(黃嘌呤與氧嗪酸鉀按1∶1比例配比的60 mg/mL混合液)0.5 mL/100 g，每天2次，而正常組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。第6天，2組大鼠右側(cè)關(guān)節(jié)腔注射30 mg/mL尿酸鈉100 μL[13]，軟尺測量大關(guān)節(jié) 2、4、6、8、10、12、24 h后的周長，計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹率，公式為關(guān)節(jié)腫脹率=[(A-B)/B]×100%，其中A為注射尿酸鈉后不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)節(jié)周長，B為未注射尿酸鈉時(shí)的關(guān)節(jié)周長。

2.2 糞便、尿液排泄實(shí)驗(yàn) 將12只模型組大鼠置于代謝籠中適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿，在0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、12～24、24～36、36～48、48 ～72 h收集尿液和糞便，準(zhǔn)確測量前者體積及后者質(zhì)量。

2.3 膽汁排泄實(shí)驗(yàn) 在糞便、尿液排泄實(shí)驗(yàn)后1 d，12只模型組大鼠禁食12 h，不禁水，20%烏來糖麻醉后將背部固定在手術(shù)臺上，于上腹部作一小切口，分離膽管，插pe10聚乙烯管引流膽汁并收集，約1 h后灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿，于0～2、2～4、4～6、6～8、8～10、10～12、12～24、24～36、36～48 h收集膽汁并記錄體積，在-80 ℃下保存。實(shí)驗(yàn)中期，大鼠股靜脈注射適量生理鹽水以補(bǔ)充失去的體液，膽汁定量稀釋后分析藥物排泄量，計(jì)算累積排泄量和累積排泄率。

2.4 樣品處理 取大鼠尿液0.1 mL，生理鹽水稀釋10倍后置于10 mL具塞試管中，加入氯仿-異丙醇混合液(4∶1)5 mL，超聲提取15 min后3 000 r/min離心5 min，取有機(jī)層，在60 ℃水浴中氮流吹干，殘?jiān)?00 μL流動相溶解，取10 μL進(jìn)樣分析。同法處理大鼠膽汁。將大鼠糞便烘干后研成粉末，稱取1 g，加入10 mL生理鹽水混勻，取1 mL，剩余處理方法同尿液。

2.5 色譜條件 ACE5 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；ZORBAX Eclipse XDC-C18保護(hù)柱(4.6 mm×12.5 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(10∶90)體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長263 nm；進(jìn)樣量10 μL。

3 結(jié)果

3.1 關(guān)節(jié)腫脹率 如圖1所示，模型組大鼠關(guān)節(jié)腫脹率在8～10 h達(dá)到最高，10 h后下降；正常組大鼠在24 h內(nèi)未發(fā)生腫脹，即關(guān)節(jié)腫脹率為0。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠關(guān)節(jié)腫脹率Fig.1 Joint swelling rates of rats at different time points

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 線性關(guān)系考察 制備系列質(zhì)量濃度鹽酸青藤堿溶液，加入定量空白生物樣品，配制8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 μg/mL樣品溶液，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以鹽酸青藤堿峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知該成分在尿液、糞便、膽汁中均呈良好的線性關(guān)系。

表1 鹽酸青藤堿線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of sinomenine hydrochloride

3.2.2 專屬性試驗(yàn) 取空白樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖2，可知該方法專屬性良好。

注：由于尿液、糞便、膽汁色譜圖相似，故限于篇幅，本實(shí)驗(yàn)只提供尿液色譜圖。1.鹽酸青藤堿1.sinomenine hydrochloride圖2 鹽酸青藤堿HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of sinomenine hydrochloride

3.2.3 精密度試驗(yàn) 制備鹽酸青藤堿低、中、高質(zhì)量濃度(9、40、80 μg/mL)的質(zhì)控樣品溶液各6份，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，同一天內(nèi)計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)5 d計(jì)算日間精密度，結(jié)果見表2，可知該方法精密度良好。

表2 鹽酸青藤堿精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Results of precision tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液適量，加入空白樣品制成低、中、高質(zhì)量濃度(9、40、80 μg/mL)的質(zhì)控樣品溶液各6份，按“2.4”項(xiàng)下方法處理，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別測定室溫下24 h、反復(fù)凍融3次，-80 ℃下30 d的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3，可知該方法穩(wěn)定性良好。

表3 鹽酸青藤堿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.3 Results of stability tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.2.5 提取回收率試驗(yàn) 制備鹽酸青藤堿低、中、高質(zhì)量濃度(9、40、80 μg/mL)的質(zhì)控樣品溶液各6份，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表4。

表4 鹽酸青藤堿提取回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.4 Results of extraction recovery tests for sinomenine hydrochloride (n=6)

3.3 排泄動力學(xué)研究 正常組、模型組大鼠灌胃給予75 mg/kg鹽酸青藤堿后，取不同時(shí)間段尿液、糞便、膽汁，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算排泄量，結(jié)果見表5，累積排泄量-時(shí)間曲線見圖3，藥動學(xué)參數(shù)見表6。

圖3 鹽酸青藤堿累積排泄量-時(shí)間曲線Fig.3 Accumulative excretion amount-time curves for sinomenine hydrochloride

表5 鹽酸青藤堿含量測定結(jié)果(n=12) Tab.5 Results of content determination of sinomenine hydrochloride (n=12)

表6 鹽酸青藤堿排泄動力學(xué)參數(shù)Tab.6 Excretion kinetic parameters for sinomenine hydrochloride n=12)

在尿液中，模型組大鼠于0～12 h檢測出原型藥物，累積排泄量占給藥量的18.65%，其中71.65%是在前6 h排泄的，12 h后排泄很少，低于HPLC法測定鹽酸青藤堿的檢測線；正常組大鼠只在0～6 h檢測出給藥量3.93%的原型藥物，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組T1/2長于正常組(P<0.05)。

在糞便中，模型組大鼠在0～6 h幾乎檢測不到鹽酸青藤堿，6～30 h檢測出給藥量11.82%的原型藥物；正常組大鼠在0～24 h檢測出給藥量6.13%的原型藥物，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組T1/2短于正常組(P<0.05)。

在膽汁中，2組均在0～6 h檢出原型藥物，其中模型組累積排泄量占給藥量的7.61%，而正常組占5.03%，2組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組T1/2短于正常組(P<0.05)。

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射黃嘌呤和氧嗪酸鉀的方法促使大鼠體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，從而使血尿酸水平升高，獲得更接近人體發(fā)病機(jī)制的急性痛風(fēng)模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌胃給藥后，少部分鹽酸青藤堿以原型藥通過糞便、尿液、膽汁排泄，而大部分在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其他形式。大鼠灌胃給予鹽酸青藤堿后，模型組、正常組分別在12、6 h內(nèi)的尿液中檢出該成分，說明其尿排泄迅速，在腎臟不易蓄積；模型組鹽酸青藤堿原型藥物排泄量約為非模型組的6倍，推測可能是由于黃嘌呤、氧嗪酸鉀腹腔注射引起大鼠腎損傷，影響鹽酸青藤堿在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化。

研究表明，健康人群、痛風(fēng)患者糞便上清液的代謝圖譜存在明顯差異，腸道菌群紊亂與痛風(fēng)發(fā)病之間存在密切關(guān)系[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糞便排泄量比正常組鹽酸青藤堿排泄多，鹽酸青藤堿在糞便中法人排泄速率也低于在尿液、膽汁中，推測腸道菌群異?？赡苁果}酸青藤堿在急性痛風(fēng)大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化過程受阻；鹽酸青藤堿經(jīng)膽汁排泄量較少，即不是主要排泄途徑，并且模型組、正常組膽汁排泄量差異較小，提示急性痛風(fēng)對該成分膽汁排泄無明顯影響。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)探討了鹽酸青藤堿在急性痛風(fēng)大鼠體內(nèi)的排泄特征，可為相關(guān)臨床治療和合理用藥提供參考。