方 媛，王勁松，呂 倩，梁曉東

微管是由α/β微觀蛋白異二聚體聚合而成、具有動態(tài)結(jié)構(gòu)的絲狀細胞骨架聚合物，存在于真核生物中，在多種細胞功能如有絲分裂、細胞運動和細胞內(nèi)運輸中發(fā)揮重要作用[1-2]。β Ⅲ-微管蛋白(β Ⅲ-tubulin, TUBB3)作為β-微管蛋白同源型的亞型，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，睪丸特別是Sertoli細胞中呈結(jié)構(gòu)性表達。研究發(fā)現(xiàn)TUBB3在多種惡性實體腫瘤，如非小細胞肺癌、卵巢癌、頭頸部癌等中高表達，提示其在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，且TUBB3高表達也與非小細胞肺癌、卵巢癌、膀胱尿路上皮癌等密切相關(guān)[2-5]。此外，TUBB3蛋白過表達在部分腫瘤中與紫杉醇、烷類靶向抗癌藥物療效降低有關(guān)，提示其可作為惡性實體腫瘤中抗癌藥敏感性的預測指標[6-8]。為進一步探討TUBB3在淋巴組織增生性病變中表達的意義，本文采用免疫組化EnVision法檢測TUBB3在腫瘤性和非腫瘤性淋巴組織增生性病變中的表達，分析其在淋巴瘤診斷與鑒別診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2013年1月～2019年12月南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院(南京市第一醫(yī)院)和南京醫(yī)科大學鹽城臨床醫(yī)學院(鹽城市第三人民醫(yī)院)病理科存檔、經(jīng)病理診斷的淋巴組織增生性病變146例。其中反應性增生淋巴結(jié)20例，非霍奇金淋巴瘤126例，包括B細胞性淋巴瘤88例：小淋巴細胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma, SLL)10例、結(jié)外黏膜相關(guān)性淋巴組織邊緣區(qū)淋巴瘤(extranodal marginal zone lymphoma of mucosa-associated lymphoid tissue, MALToma)10例、濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)24例、套細胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)5例、彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)39例；T細胞性和NK細胞性淋巴瘤38例：外周T細胞性淋巴瘤(非特指型)15例、NK/T細胞性淋巴瘤15例、間變性大細胞性淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma, ALCL)3例、血管免疫母細胞性T細胞性淋巴瘤(angioimmunoblastic T-cell lymphoma, AITL)5例。

1.2 方法標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化EnVision法染色。兔抗人單克隆抗體TUBB3(EP1569Y，稀釋比1 ∶500)購自Abcam公司。具體操作步驟：組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，置于煮沸的檸檬酸鹽修復液(pH 6.0)中用高壓鍋高溫高壓抗原修復，10%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，其余步驟采用全自動免疫組化儀(Dako AutoLink 48)進行，DAB染色，蘇木精復染，中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判斷TUBB3定位于細胞質(zhì)，當陽性細胞數(shù)>10%時判斷為陽性。根據(jù)細胞染色強度將TUBB3染色分為：弱陽性，染色強度低于內(nèi)對照染色；強陽性，染色強度明顯高于內(nèi)對照染色；中等陽性，染色強度介于弱陽性和強陽性之間。以病變內(nèi)血管內(nèi)皮細胞或神經(jīng)纖維作為陽性內(nèi)對照，PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。不同組別淋巴瘤TUBB3陽性率采用χ2或Fisher確切概率法處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 反應性增生淋巴結(jié)中TUBB3的表達TUBB3在淋巴結(jié)反應性增生中的表達主要局限于淋巴濾泡的生發(fā)中心內(nèi)(圖1)，尤其是表達于較大的細胞，較小的細胞不表達(圖2)。濾泡間區(qū)以及濾泡周圍除了血管內(nèi)皮陽性外，這些區(qū)域的淋巴細胞均不表達TUBB3。

2.2 成熟小B細胞性淋巴瘤中TUBB3的表達10例SLL均不表達TUBB3(圖3)，但可見淋巴瘤細胞植入淋巴濾泡內(nèi)(圖4)。10例MALTomas中，除殘留的淋巴濾泡表達TUBB3外，腫瘤細胞均不表達TUBB3。5例MCL中，1例TUBB3強表達于殘留淋巴濾泡，而周圍的腫瘤細胞呈中等表達(圖5)。24例低級別FL中，8例表達TUBB3，其中3例中等表達，5例弱表達，TUBB3表達主要位于腫瘤性濾泡內(nèi)，濾泡之間有散在表達(圖6)。

2.3 DLBCL中TUBB3的表達39例DLBCL中，15例表達TUBB3，6例為弱表達(圖7)，9例為中等表達(圖8)。其中2例EBV+DLBCL中，1例表達TUBB3。根據(jù)細胞來源進行分組：14例為生發(fā)中心樣(germinal center B-like, GCB)型，6例表達TUBB3；23例為非生發(fā)中心樣(non-germinal center B-like, non-GCB)型，8例表達TUBB3；兩者間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.241，P=0.623)。

2.4 T細胞性和NK細胞性淋巴瘤中TUBB3的表達15例外周T細胞性淋巴瘤(非特指型)中，3例表達TUBB3，其中2例為弱表達，1例為中等表達(圖9)。15例NK/T細胞性淋巴瘤、3例ALCL和5例AITL，均不表達TUBB3。

①②③④⑤⑥⑦⑧⑨

2.5 成熟小B細胞性淋巴瘤和DLBCL中TUBB3的表達TUBB3在DLBCL中的陽性率為38.5%，而在成熟小B細胞性淋巴瘤總陽性率為18.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.421，P=0.036)。

2.6 B細胞性、T細胞性和NK細胞性淋巴瘤中TUBB3的表達TUBB3在B細胞性淋巴瘤中的陽性率為27.3%，明顯高于其在T細胞性和NK細胞性淋巴瘤(7.9%)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.919，P=0.015)。

3 討論

人TUBB3基因位于染色體16q24.3上，由4個外顯子組成，編碼450個氨基酸。與其他β-微管蛋白相似，TUBB3有1個GTP酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在調(diào)控微觀動態(tài)中必不可少。研究發(fā)現(xiàn)，TUBB3與ERCC1、RRM1、TYMS和TOP2A等基因聯(lián)合檢測，不僅可指導多種惡性腫瘤患者的個體化治療選擇，還可以預測甲狀腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者的預后[9-13]。我們在日常各種癌癥耐藥基因檢測工作中發(fā)現(xiàn)TUBB3不僅在腫瘤細胞中表達，而且在附帶的腫瘤周圍反應性淋巴結(jié)組織中生發(fā)中心內(nèi)高表達。檢索國內(nèi)外文獻，國外只有極少數(shù)TUBB3在淋巴組織增生性病變中表達的報道，且研究結(jié)果不一致，而國內(nèi)尚未見相關(guān)文獻報道[14-15]。

本實驗分析20例反應性增生淋巴結(jié)，結(jié)果顯示TUBB3均高表達于反應性增生淋巴結(jié)的淋巴濾泡生發(fā)中心內(nèi)，而淋巴濾泡的套區(qū)和邊緣區(qū)以及濾泡間區(qū)均未見TUBB3表達，本組結(jié)果與文獻報道一致。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)TUBB3在人淋巴組織內(nèi)生發(fā)中心的明區(qū)和暗區(qū)彌漫表達，而CD21相對集中于明區(qū)表達，提示TUBB3是比CD21更寬譜系的濾泡樹突細胞的標志物。Yoon等[14]研究發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心內(nèi)TUBB3陽性細胞的數(shù)量大于CD21/CD35陽性濾泡樹突細胞數(shù)量，采用BCL-6和TUBB3雙染顯示有些BCL-6核陽性細胞中，其胞質(zhì)也表達TUBB3。Yusof等[15]研究發(fā)現(xiàn)正常淋巴結(jié)內(nèi)TUBB3也局限于生發(fā)中心內(nèi)，且主要表達于較大細胞，而生發(fā)中心內(nèi)的小細胞以及生發(fā)中心周圍的細胞不表達，但未見濾泡樹突細胞網(wǎng)標記。本實驗結(jié)果顯示，TUBB3在反應性淋巴結(jié)生發(fā)中心內(nèi)呈彌漫強表達，而生發(fā)中心周圍的邊緣區(qū)、套區(qū)以及濾泡間區(qū)均不表達，提示TUBB3可作為潛在的生發(fā)中心細胞標志物。

在B細胞性淋巴瘤中，Yoon等[14]研究發(fā)現(xiàn)12例FL、7例MCL和8例SLL均不表達TUBB3。62例邊緣區(qū)B細胞性淋巴瘤中，除了腫瘤內(nèi)殘留或淋巴瘤細胞植入的濾泡表達TUBB3外，腫瘤細胞也不表達TUBB3。28例散發(fā)性伯基特淋巴瘤中，21例TUBB3彌漫表達。210例DLBCL中，32例(15.2%)呈不同程度TUBB3表達，且GCB型中TUBB3表達明顯高于non-GCB型，TUBB3表達與CD10表達強烈相關(guān)。Yusof等[15]研究結(jié)果顯示TUBB3在邊緣區(qū)淋巴瘤和慢性淋巴細胞白血病/SLL中不表達或弱表達，而92%(11/12)MCL和40%(8/20) FL表達TUBB3；6例伯基特淋巴瘤呈不同強度TUBB3表達；171例DLBCL中，58例(36%)不同程度表達TUBB3，根據(jù)細胞來源進行亞組分型發(fā)現(xiàn)TUBB3在GCB型中的表達明顯低于non-GCB型(12%vs58%)。本實驗發(fā)現(xiàn)SLL和MALToma均不表達TUBB3；20%(1/5) MCL表達TUBB3；24例低級別FL中，8例表達TUBB3，其中3例中等表達，5例弱表達；39例DLBCL中15例表達TUBB3，6例為弱表達，9例為中等表達。根據(jù)細胞來源進行分組發(fā)現(xiàn)TUBB3在GCB型中的表達雖然低于non-GCB型，但兩者差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)合文獻與本組結(jié)果提示TUBB3可以識別SLL和MALToma中殘留的濾泡生發(fā)中心或被淋巴瘤細胞植入的淋巴濾泡生發(fā)中心，有助于淋巴瘤的診斷。本實驗MCL中TUBB3陽性率為20%，與文獻報道相似[14-15]。本組中FL與Yusof等報道相似，但與Yoon等研究結(jié)果不同，可能與抗體克隆號不同、病例數(shù)較少有關(guān)。值得注意的是，F(xiàn)L中TUBB3陽性主要集中于腫瘤性濾泡內(nèi)，但TUBB3陽性細胞數(shù)及表達強度明顯低于反應性增生淋巴濾泡生發(fā)中心。這提示在以濾泡結(jié)構(gòu)為主的FL診斷中，根據(jù)濾泡內(nèi)TUBB3陽性細胞數(shù)量及表達強度，并結(jié)合BCL-2表達，可有助于低級別FL和反應性增生淋巴結(jié)的鑒別。文獻報道DLBCL中TUBB3的陽性率不盡相同，但TUBB3在GCB型中的表達高于non-GCB型，提示在DLBCL難以分型的情況下，TUBB3陽性可能提示為GCB型DLBCL。

T細胞性和NK細胞性淋巴瘤中，Yoon等研究發(fā)現(xiàn)AITL和外周T細胞性淋巴瘤(非特指型)均不表達TUBB3；25例NK/T細胞性淋巴瘤中，僅有2例(8%)彌漫表達TUBB3；29例ALCL中有23例表達TUBB3，其中系統(tǒng)性ALCL中TUBB3陽性率為87.5%(21/24)，明顯高于原發(fā)性皮膚ALCL(40%，2/5)。Yusof等報道13%(1/8)外周T細胞性淋巴瘤、20%(1/5)NK/T細胞性淋巴瘤、75%(3/4)AITL和50%(1/2)ALK-ALCL表達TUBB3。本組結(jié)果顯示，20%(3/15)的外周T細胞性淋巴瘤(非特指型)表達TUBB3，而15例NK/T細胞性淋巴瘤、3例ALCL和5例AITL均不表達TUBB3。本組結(jié)果與文獻報道不一致，可能是由于病例數(shù)較少有關(guān)，需積累更多病例進一步分析TUBB3在T細胞性和NK細胞性淋巴瘤中的表達。

惡性淋巴瘤中，DLBCL比小B細胞性淋巴瘤具有更高的惡性行為以及更差的預后。文獻報道惡性腫瘤中TUBB3高表達與腫瘤更高的惡性生物學行為密切相關(guān)。本組結(jié)果顯示，TUBB3在DLBCL中的表達高于其他小B細胞性淋巴瘤，提示TUBB3表達也與淋巴瘤的臨床生物學行為有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肺癌、卵巢癌、乳腺癌和胃癌等多種惡性腫瘤中TUBB3表達水平高，與長春花堿或紫杉醇、烷類靶向抗癌藥耐藥有關(guān)[17]。長春花堿是治療淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的常用化療藥物，淋巴瘤中TUBB3表達可能會提示患者對該藥物不敏感。本組發(fā)現(xiàn)B細胞性淋巴瘤中TUBB3表達高于T細胞性和NK細胞性淋巴瘤，可能由于TUBB3是潛在的生發(fā)中心標志物，而一些B細胞性淋巴瘤如FL、DLBCL起源于濾泡生發(fā)中心B細胞。

綜上所述，TUBB3高度局限于反應性增生淋巴濾泡生發(fā)中心內(nèi)，可能是潛在的生發(fā)中心細胞標志物。TUBB3能識別小B細胞性淋巴瘤中殘留的濾泡生發(fā)中心，或被淋巴瘤細胞植入的生發(fā)中心可有助于SLL和MALToma的診斷。在以濾泡結(jié)構(gòu)為主的淋巴結(jié)病變內(nèi)，根據(jù)TUBB3表達細胞的數(shù)量及表達強度，結(jié)合BCL-2檢測可以區(qū)分FL和反應性增生淋巴結(jié)。