郭麗媛，張金業(yè)

(1.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 226001；2.南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001)

食管癌具有高發(fā)病率、高致死率的特征，是臨床上常見的惡性腫瘤之一[1]。從組織學(xué)類型上，食管癌可分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)。盡管食管癌的治療方法不斷進(jìn)步，但依據(jù)癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，食管癌5年生存率僅為20%[2]。目前臨床上ESCC尚未有明確的分子靶向藥物，因此，需進(jìn)一步尋找更有效的腫瘤標(biāo)志物以實(shí)現(xiàn)早診斷、早治療，降低患者死亡率。Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)作為Rho家族成員之一，是一種鳥嘌呤核苷酸激活蛋白(GTP)酶[3]。研究表明，Rac1在乳腺癌、肝癌和肺癌等腫瘤中呈高表達(dá)，且與預(yù)后不良有關(guān)，可作為有效的治療靶點(diǎn)[4-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Rac1在ESCC中呈高表達(dá)，并與ESCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。本文就 Rac1在ESCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制、Rac1基因的檢測(cè)技術(shù)以及臨床治療中的應(yīng)用作一綜述。

1 Rac1的結(jié)構(gòu)及功能

Rac1基因位于人染色體7p22，含有7個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。該基因編碼的蛋白質(zhì)是GTP酶(GTPase)，屬于小GTP結(jié)合蛋白R(shí)as超家族[8]。該超家族的成員調(diào)控著一系列不同的細(xì)胞事件進(jìn)程，包括控制細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞骨架重組和蛋白激酶的激活等。Rac1蛋白包括核苷酸結(jié)合位點(diǎn)、開關(guān)一、開關(guān)二、多堿基區(qū)和C-末端膜靶向區(qū)域5個(gè)結(jié)構(gòu)域，任意1個(gè)出現(xiàn)錯(cuò)義突變即可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Rac1有2種存在形式，分別為可被鳥嘌呤核苷酸交換因子激活至 GTP 結(jié)合狀態(tài)，以及被GTPase失活至 GDP 結(jié)合狀態(tài)。在其 GTP結(jié)合狀態(tài)下，在多種細(xì)胞互相作用的過(guò)程(如細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡、周期調(diào)控和細(xì)胞骨架重組等)中起著重要作用[9]。Rac1 及其細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可對(duì)腫瘤產(chǎn)生以下5種作用：抗凋亡、促增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、癌癥干細(xì)胞和促血管生成。

2 Rac1檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

研究表明，Rac1表達(dá)的量及活性均影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此，Rac1的早期檢測(cè)可為腫瘤的診治提供重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.1Rac1蛋白和基因表達(dá)的檢測(cè)技術(shù) 主要包括：實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemistry,IHC)、蛋白質(zhì)免疫印跡(western blot)技術(shù)以及免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence，IF)。IHC、western blot、IF都是利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)基因進(jìn)行定量或定位的檢測(cè)手段，檢測(cè)方法較簡(jiǎn)單，特異性高，定位準(zhǔn)確，但對(duì)儀器的要求比較高。例如，Yang等[7]采用RT-PCR、western blot和IHC技術(shù)發(fā)現(xiàn)Rac1在ESCC組織中的蛋白質(zhì)及基因水平的表達(dá)上調(diào)，并且證實(shí)了Rac1的高表達(dá)與腫瘤的侵犯深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低存活率相關(guān)。Yuan等[10]采用IF技術(shù)證實(shí)了Rac1在ESCC細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)Rac1越聚集在細(xì)胞膜前緣，則腫瘤細(xì)胞的遷移能力越強(qiáng)。對(duì)Rac1檢測(cè)定量分析最準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是qRT-PCR，該技術(shù)的靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，但qRT-PCR結(jié)果的影響因素很多，如重復(fù)洗滌、離心、純化等步驟均可造成相當(dāng)數(shù)量的核酸損失。目前開發(fā)的基于液滴的數(shù)字PCR(dPCR)技術(shù)可避免上述缺陷，在 dPCR中，樣品被稀釋，每個(gè)單獨(dú)的分區(qū)包含不超過(guò)1個(gè)目標(biāo)序列，dPCR提供了絕對(duì)值和可分析的定量數(shù)據(jù)，極大地提高了稀有序列檢測(cè)的靈敏度、特異性，克服了腫瘤細(xì)胞低核酸的缺點(diǎn)[11]。目前國(guó)內(nèi)尚未見采用dPCR檢測(cè)ESCC患者Rac1表達(dá)的研究報(bào)道。尚需更深層次研究，為在早期階段檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.2Rac1活性的檢測(cè)技術(shù) 谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶下拉法(Glutathione-S-transferase pull down assay，GST pull down assay)是目前臨床上常用的檢測(cè)Rac1活性的方法。GTS-pull down法主要利用某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域能夠與GTP-Rac1相結(jié)合的特性，構(gòu)建出該結(jié)構(gòu)域的GST融合蛋白，通過(guò)GST-pull down方法富集激活形式的Rac1，并且能夠動(dòng)態(tài)反映細(xì)胞內(nèi)Rac1的活性變化，具有較高的準(zhǔn)確性和特異性，但偶爾會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[12]。Yuan等[10]采用GTS-pull down法檢測(cè)Rac1在ESCC組織中的活性，證實(shí)Rac1活性越高，遷移能力則越強(qiáng)。其進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Rac1與腫瘤的進(jìn)展呈正相關(guān)，且在發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中，Rac1的表達(dá)水平比未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者明顯升高，且預(yù)后較差。但由于現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的限制，尚未見在外周血中能檢測(cè)Rac1的活性變化的報(bào)道。因此，還需進(jìn)一步深入研究Rac1活性的檢測(cè)技術(shù)及臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 Rac1與ESCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移

3.1Rac1促進(jìn)ESCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移 Rac1蛋白高表達(dá)與Rac1基因突變及活性異常有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Rac1突變體的形成及其上游分子異常啟動(dòng)可使活性增強(qiáng)，從而啟動(dòng)一系列信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。另有研究表明，小GTPase Rac1參與了F-肌動(dòng)蛋白和黏著斑動(dòng)力學(xué)，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白在前沿聚合產(chǎn)生突起，過(guò)度激活的Rac1可增強(qiáng)細(xì)胞遷移[14]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)組裝成絲狀體和微梭形結(jié)構(gòu)啟動(dòng)了細(xì)胞遷移，Rac1的表達(dá)和激活可促進(jìn)此進(jìn)程。此外，EMT與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前研究表明，Rac1與EMT關(guān)系密切，Rac1可通過(guò)以下幾種途徑實(shí)現(xiàn)EMT，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，包括：其上游效應(yīng)物過(guò)表達(dá)/過(guò)活性(生長(zhǎng)因子)；下游效應(yīng)物激活P21活化蛋白激酶(p21-activated kinases，PAK)；Rac1活性增加；間接變異體(如Rac1b)表達(dá)；上調(diào)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑；激活轉(zhuǎn)錄激活因子3；促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架片狀足形成；促進(jìn)活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)物形成及應(yīng)激反應(yīng)蛋白(如p38)的激活[9]。通過(guò)以上機(jī)制，Rac1不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)展，也促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

3.2Rac1促進(jìn)ESCC轉(zhuǎn)移的信號(hào)通路 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，一種新的天然大環(huán)內(nèi)酯F806可下調(diào)Rho家族(CDC42、Rac1)的表達(dá)和活性，從而中斷F-肌動(dòng)蛋白遷移成分的組裝，抑制癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在ESCC中，Rac1的表達(dá)受趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的趨化因子受體(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)的調(diào)節(jié)，敲低CXCR4可顯著抑制AKT和ERK的磷酸化以降低Rac1蛋白的水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[16-17]。研究證實(shí)，微小核糖核酸(miRNA)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、DNA修復(fù)、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和耐藥中均具有重要作用[18]。Ma等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-92b在ESCC中呈高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，其進(jìn)一步證實(shí)MicroRNA-92b可通過(guò)抑制整合素αV 的表達(dá)發(fā)揮其抑制功能，降低了磷酸化黏著斑激和Rac1的激活，從而影響侵襲與遷移。Tanabe等[20]通過(guò)免疫組織化學(xué)證實(shí)，Rac1的活性受絲狀蛋白C(filamin C，F(xiàn)LNC)的調(diào)節(jié)，F(xiàn)LNC在ESCC中的表達(dá)與淋巴侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)，F(xiàn)LNC可激活Rac1，使細(xì)胞侵襲、遷移能力增強(qiáng)。Wen-Jian等[21]發(fā)現(xiàn)，在ESCC中，14-3-3ε基因與T 淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1的結(jié)合可促進(jìn)Rac1的激活。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)，球姜酮(Zerumbon,ZER)可通過(guò)促進(jìn)Rac1泛素化，導(dǎo)致Rac1的降解，抑制ESCC的遷移。以上研究證實(shí)，Rac1對(duì)ESCC的影響主要為上游分子導(dǎo)致Rac1的激活或表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，如若Rac1降解，則對(duì)腫瘤的進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用。

4 Rac1在抗腫瘤治療中的應(yīng)用

研究表明，Rac1抑制劑在抗腫瘤的療效評(píng)價(jià)中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，針對(duì)Rac1的放化療方案、靶向治療及免疫治療均取得了較好的療效[23]。Rac1抑制可逆轉(zhuǎn)乳腺癌的順鉑耐藥[24]；在非小細(xì)胞肺癌中，Rac1誘導(dǎo)的EMT與增強(qiáng)的癌細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)，并與放療抵抗密切相關(guān)[25]；對(duì)于靶向治療，Rac1的激活可增加肺癌對(duì)吉非替尼的耐藥性[26]。此外，研究表明，抑制Rac1能夠阻礙腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[27]。由此可見，Rac1抑制劑在腫瘤治療中具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。Xu等[28]發(fā)現(xiàn)，整合素β1通過(guò)調(diào)節(jié)FAK-Rac1信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞活性，并下調(diào)ESCC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，表明整合素β1可作為ESCC治療靶點(diǎn)。筆者推測(cè)，阻斷Rac1信號(hào)通道的傳導(dǎo)可增強(qiáng)ESCC對(duì)順鉑的敏感性，但尚需進(jìn)一步的臨床研究證實(shí)。

5 小結(jié)及展望

RAC1廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞中，Rac1的突變與活性異常在ESCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，目前已開發(fā)出多種技術(shù)用于Rac1的表達(dá)及活性的檢測(cè)，但仍需要研發(fā)新型檢測(cè)技術(shù)以提高Rac1的檢出率，為早期診斷和早期治療提供新的依據(jù)。通過(guò)研究Rac1的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控的信號(hào)通路，有望為ESCC分子靶向藥物治療提供新途徑。因此，對(duì)Rac1進(jìn)行更深層次的認(rèn)識(shí)及靶向調(diào)控的研究，可為新型抗腫瘤靶向藥物的開發(fā)提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為ESCC的臨床治療提供更多的選擇，為改善腫瘤患者病情及提高存活率帶來(lái)新希望。