劉璐瑤，孫 雪，馬萬鵬，王 琦，劉肖利，蘇戰(zhàn)強

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】呼吸系統(tǒng)疾病是雞的一類多發(fā)性疾病，其發(fā)病原因復(fù)雜，治療效果差，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失?！厩叭搜芯窟M展】以呼吸極度困難為主要癥狀的呼吸系統(tǒng)疾病，主要表現(xiàn)為雞的一側(cè)或者雙側(cè)支氣管有黃白色干酪樣物質(zhì)栓塞[1-3]。有文獻(xiàn)顯示因支氣管堵塞死亡500多只雞[4]，以及死雞剖檢后在支氣管與所管分叉處的氣管環(huán)處有明顯拴塞物[5]?！颈狙芯壳腥朦c】雞支氣管堵塞死雞病不能確定其發(fā)病原因[6]。雞支氣管堵塞的發(fā)病原因較多，患雞肺和支氣管的纖維素樣堵塞均是由H9亞型禽流感或雞傳染性支氣管炎等病毒病引起的，并多伴有支原體或大腸桿菌的繼發(fā)感染[7]。雞呼吸道堵塞的形成與環(huán)境因素關(guān)系較大，H9亞型禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎、禽曲霉菌病及沙門氏菌病等都有可能參與這種病變的形成[8]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】針對支氣管堵塞病例，用常規(guī)細(xì)菌分離法和結(jié)合16 sDNA測序進行細(xì)菌學(xué)分析。研究支氣管堵塞形成過程中細(xì)菌的作用，為獸醫(yī)臨床防控和治療該類疾病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 動物及病料

健康昆明系小白鼠，18～25 g/只，54只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

無菌截取約0.8～1 cm的氣管末端典型病變組織，置于4 mL Ep管中，低溫保存，及時進行細(xì)菌學(xué)分析。圖1

注：(a)支氣管末端分叉處有中空的黃色干酪樣堵塞物充滿管腔；(b)管腔內(nèi)取出的堵塞物

1.1.2 試劑儀器及引物

試劑：麥康凱瓊脂(MAC)、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂、Mueller-Hinton瓊脂(以下簡稱MH)，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。雞支原體培養(yǎng)基、法國科瑪嘉尿路菌群顯色培養(yǎng)基(CHROMagar)、腦心浸出液肉湯(Brain Heart Infusion Broth BHI)，藥敏紙片：頭孢噻肟(CTX 30 μg)、頭孢他啶(CAZ 30 μg)、慶大霉素(CN 10 μg)、阿米卡星(AN 30 μg)、四環(huán)素(TE 30 μg)、氨芐西林(Amp 10 μg)、環(huán)丙沙星(CIP 5 μg)、左氧氟沙星(LEV 5 μg)、氯霉素(CHL 30 μg)、氨曲南(AZT 30 μg)、復(fù)方新諾明(SMZ 23.75 μg)，細(xì)菌微量生化鑒定管購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。5%綿羊血平板，自制。PCR反應(yīng)相關(guān)試劑(2×TaqPCR Green Mix、ddH2O)，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

自動高壓滅菌鍋(HVE-50)，離心機(Eppendorf AG 22331 Hamburg)，空氣浴振蕩培養(yǎng)箱(ST-F160AC)，TProfessional PCR 儀Biometra公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為Universal Hood ll Bio-Rad公司產(chǎn)品。Eppendorf Mastercycler nexus GSX1 PCR儀；DYY-7C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

引物合成：參照文獻(xiàn)選擇引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。表1

表1 引物基本信息

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將病料置于支原體液體培養(yǎng)基和BHI液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1～7 d和24 h。支原體液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中觀察的顏色變化。將BHI菌液劃線接種科馬嘉顯色培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24 h，將不同形態(tài)、大小、色澤和濕潤度的菌落分別劃線接種5%綿羊血平板進行純化培養(yǎng)。

1.2.2 PCR和生化鑒定

支原體初篩為陽性的菌液進行特異性擴增，提取純化后的菌株模板DNA后，用16S rDNA進行擴增。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠在20xTAE電泳液中電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)中記錄結(jié)果。有清晰明亮的條帶所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物送至鼎國生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，所得序列在BLAST上進行同源性比對，根據(jù)比對結(jié)果訂購相應(yīng)菌株的特異性引物，進行PCR鑒定，同時參考文獻(xiàn)中方法，對菌株進行生化鑒定實驗，觀察并記錄結(jié)果[9-13]。

1.2.3 藥敏試驗

按Kirby-Bauer法，用MH培養(yǎng)基進行藥敏試驗。菌液制備用MH液體培養(yǎng)基稀釋菌株到0.5麥?zhǔn)蠞岫?，用滅菌的棉拭子蘸取菌液均勻涂布?0 mm培養(yǎng)基表面，開蓋靜置3～5 min后用鑷子夾取藥敏片放置在培養(yǎng)基上，貼好后靜置15 min后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。用大腸桿菌ATCC 25922作質(zhì)控菌株，判定標(biāo)準(zhǔn)按美國 NCCLS 操作標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.2.4 小鼠致病性試驗

挑取純化的單菌落接種于無菌EC肉湯中培養(yǎng)12～18 h，使用分光光度計測定OD600 nm，將培養(yǎng)過后的菌液稀釋，并將OD600 nm固定到1。取體重為20～25 g雌性昆明小白鼠禁食不禁水12 h后，隨機分為3組，每組18只，分別為大腸桿菌菌株試驗組、糞腸球菌菌株試驗組、空白對照組。試驗組小鼠腹腔注射菌液，0.3 mL/只，對照組注射同劑量無菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)，研究小白鼠的臨床癥狀，死亡后剖檢，觀察病變并采集小鼠脾臟和肝臟培養(yǎng)和鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離鑒定

研究表明，11個雞場(A-K)共采集了18份樣本。綜合樣本信息，A、B、C、D、E、L雞場于6月發(fā)病，F(xiàn)場發(fā)病于7月發(fā)病，G、H雞場于8月發(fā)病，I、J雞場發(fā)病于9月，K雞場于12月發(fā)病。每個雞場收集樣本1份，其中J場收集了8份樣本。

樣本用雞支原體液體培養(yǎng)基進行初步篩選時，將出現(xiàn)的疑似陽性菌液，使用雞毒支原體和滑液支原體特異性引物進行擴增，并未出現(xiàn)目的條帶?？岂R嘉培養(yǎng)基上最多出現(xiàn)4種不同顏色和形態(tài)的菌落，依據(jù)血平板生長特點、革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，歸類出4種不同的菌，標(biāo)記為1類菌、2類菌、3類菌、4類菌。11個雞場(A-K)樣本中都能分離出1類菌和2類菌，H和I雞場有3類菌，J場3號樣本中有4類菌。圖2，表2

表2 菌株培養(yǎng)特性

圖2 科馬嘉培養(yǎng)基長出的不同形態(tài)的菌落

4種菌的DNA模板經(jīng)16S rDNA擴增后測序，結(jié)果1類菌與大腸桿菌同源性達(dá)99%～100%；2類菌與糞腸球菌同源性達(dá)96%～100%；3類菌與奇異變形桿菌同源性為97%；4類菌與鮑曼不動桿菌同源性為93%。

1類菌在MAC培養(yǎng)基上為粉紅色菌落，用大腸桿菌特異性引物進行擴增，均在1 439 bp處出現(xiàn)目的條帶；2類菌在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂上為褐色菌落，菌落周圍變黑，進行糞腸球菌的特異性擴增，所有該類菌均在1 271 bp處出現(xiàn)目的條帶。圖3～6

圖3 1類菌在MAC上呈粉紅色

圖4 2類菌在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂上呈褐色菌落

注：1～20：樣本，21：陰性，M：2 000 Maker

注：1～19：樣本，泳道20：陰性對照，M：2 000 Maker

研究表明，1類菌吲哚陽性，MR陽性，VP陰性，丙二酸鹽陰性，均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。個別菌株在蔗糖、麥芽糖、精氨酸、鳥氨酸、西門氏枸櫞酸鹽上的反應(yīng)有所差異，僅1株菌可產(chǎn)硫化氫，但所有生化反應(yīng)完全符合大腸桿菌的特性。

2類菌甘油陽性，硫化氫陰性，大部分菌株發(fā)酵蔗糖，少部分發(fā)酵蜜二糖和阿拉伯糖，符合糞腸球菌的生化特性。但所有菌株都能發(fā)酵葡萄糖這一指標(biāo)與文獻(xiàn)中判定為致病性糞腸球菌的指標(biāo)不符，分離到的糞腸球菌可能不屬于致病性糞腸球菌。

3類菌和4類菌奇異變形桿菌和鮑曼不動桿菌。圖7

圖7 不同雞場氣管堵塞部位的細(xì)菌分離鑒定

2.2 藥敏

研究表明，樣本中所有大腸桿菌株均對SMZ、TE、Amp表現(xiàn)出100%耐藥，所有的糞腸球菌對AZT表現(xiàn)出100%耐藥。表5

表5 大腸桿菌、糞腸球菌耐藥情況統(tǒng)計

18株大腸桿菌在以SMZ、TE、Amp耐藥的基礎(chǔ)上與其他藥物出現(xiàn)了13種耐藥組合。18株糞腸球菌出現(xiàn)了14種耐藥組合。不同雞場、個體間的藥物敏感性差異。圖8，圖9

圖8 A-K雞場大腸桿菌分離株對11種藥物的耐藥組合

圖9 A-K雞場糞腸球菌分離株對11種藥物的耐藥組合

2.3 小鼠致病性

將分離得到的菌株接種小白鼠，試驗組小白鼠經(jīng)腹腔注射菌液后均無明顯的臨床癥狀，無死亡現(xiàn)象；空白對照組無異常。

3 討 論

雞支氣管堵塞常常導(dǎo)致巨大經(jīng)濟的損失，采取生物安全防控和疫苗免疫在內(nèi)的眾多措施去預(yù)防此類疾病，但是這幾年發(fā)病趨勢不降反升[13]。研究者們普遍認(rèn)為，支氣管堵塞病變的形成是多因素的。在非細(xì)菌學(xué)方面，有研究證明新城疫能引起支氣管的栓塞[15]，禽流感9亞型也能引起相同的病變[16]。有研究證明，鼻氣管鳥桿菌單獨能引起三叉管堵塞病變[17]。許多研究表明了支原體、真菌均能引起雞三叉管的堵塞。不同于實驗室研究，在生產(chǎn)中很難遇到單一病原的疾病，許多研究者都假設(shè)有一些細(xì)菌性的致病菌也參與了該種病理變化的形成。研究對11個雞場的18份樣本進行了研究，結(jié)果從發(fā)病部位共分離到4種細(xì)菌，所有雞場都有大腸桿菌和糞腸球菌，個別雞場有奇異變形桿菌或鮑曼不動桿菌。這說明大腸桿菌和糞腸球菌的存在具有普遍性，與之前的許多研究結(jié)果相一致[18, 19]。并且許多報道都提及大腸桿菌和沙門氏菌的某些菌株可引發(fā)敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎等癥狀[20, 21]。有些雞場分離到了奇異變形桿菌或鮑曼不動桿菌，但無相關(guān)報道證明它們能引起禽類呼吸系統(tǒng)疾病，其是否參與雞支氣管堵塞形成方面的機理有待研究。

大腸桿菌和腸球菌普遍存在于雞的腸道內(nèi)，隨糞便排出后會污染環(huán)境，是重要的條件致病菌，也是養(yǎng)雞業(yè)的一大隱患。有學(xué)者證明，當(dāng)?shù)椭虏⌒圆《靖腥倦u后再接種低致病性大腸桿菌，比二者單獨感染的致死率要高，并且氣管接種大腸桿菌的主要表現(xiàn)為呼吸道的炎癥反應(yīng)[22]。當(dāng)一些粉塵、病毒等損傷禽呼吸道氣管粘膜的完整性后，菌體在呼吸道內(nèi)迅速增殖，繼而引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病[23]。新疆雞養(yǎng)殖場的環(huán)境差、粉塵多，這可能會增加這些細(xì)菌的致病力。通過生化實驗和小鼠致病性試驗可知此次研究中分離的大腸桿菌和糞腸球菌不具有致病力，有報道也指出腸球菌很少出現(xiàn)單獨感染，多是在與其它細(xì)菌協(xié)同下發(fā)生感染，并能增加患病動物的致死率和腹膜炎的發(fā)生率[24]。

大腸桿菌和糞腸球菌都是重要的耐藥研究對象，近年來這2種菌的耐藥問題日漸突出，耐藥菌譜不斷擴大，耐藥程度也日趨嚴(yán)重。此次試驗中大腸桿菌和糞腸球菌的耐藥情況嚴(yán)重，其耐藥性還存在明顯的差異，其中大腸桿菌的耐藥性比糞腸球菌要嚴(yán)重。曲志娜等[25]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有12種藥物的耐藥率在50%以上，其中對氨芐西林(87.21%)、四環(huán)素(86.99%)和復(fù)方新諾明(86.99%)的耐藥率較高。11個雞場的大腸桿菌對這3種藥物的耐藥率均達(dá)到了100%，所有菌株在此基礎(chǔ)上搭配組合出了13種耐藥譜型，以CTX、SMZ、TE、AMP、CIP、LEV、CHL這種耐藥譜型較為常見，整體雞源大腸桿菌呈現(xiàn)出的多重耐藥問題嚴(yán)重且復(fù)雜多樣。在養(yǎng)殖過程中應(yīng)緩解該類抗生素的使用，并提倡聯(lián)合用藥。相比大腸桿菌，腸球菌具有更強的獲得、表達(dá)和轉(zhuǎn)移耐藥性的能力[26]。選擇相同藥物進行糞腸球菌的藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌較大腸桿菌耐藥情況較輕，僅對氨曲南表現(xiàn)出100%的耐藥，大部分菌株對頭孢他啶(89.8%)、復(fù)方新諾明(89.8%)、頭孢噻肟(83.3%)耐藥率較高，結(jié)果相比蘇崴藝等[27]報道的耐藥情況輕。F雞場僅對氨基糖苷類藥物表現(xiàn)出了耐藥，該場可能存在氨基糖苷類藥物濫用的情況[27, 28]。

4 結(jié) 論

除了F雞場、J雞場2號和4號樣本外，其余16株糞腸球菌都為多重耐藥的糞腸球菌。同一樣本中分離出的大腸桿菌和糞腸球菌對11種藥物都表現(xiàn)出不同的耐藥特點。大腸桿菌對CTX、SMZ、CN、TE、AMP、CIP、LEV和CHL的耐藥性高于糞腸球菌，在臨床上對于大腸桿菌感染經(jīng)驗應(yīng)避免使用上述藥物。CAZ、AN和AZT的耐藥性大腸桿菌低于糞腸球菌，選用以上藥物作為大腸桿菌的經(jīng)驗用藥。