湯雅淇，李珂，艾軍，嚴(yán)紅亞，信愛國(guó)*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201； 3.昆明海關(guān)技術(shù)中心，云南 昆明 650200)

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV)引起豬、牛、羊等偶蹄動(dòng)物的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播速度快、流行范圍廣，病毒可通過接觸易感動(dòng)物和空氣傳播，易感動(dòng)物接觸病毒后2～3d產(chǎn)生臨床癥狀，發(fā)病率為100%，幼畜經(jīng)常不見癥狀而猝死，死亡率因病毒株而異，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100%。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口瘡病毒屬(Aphthovirus)成員，基因組為一長(zhǎng)約8 500 bp的單股正鏈RNA分子[1]。FMDV目前已知有7個(gè)不同的血清型(A、O、C、Asia1和南非1、2、3型)，在每個(gè)血清型內(nèi)存在多種亞型，不同血清型間無交叉免疫性。目前，O型FMDV存在10個(gè)不同拓?fù)湫?，即中東-南亞 (ME-SA)、東南亞 (SEA)、古典中國(guó)拓?fù)湫?CATHAY)、歐洲-南美 (Euro-SA)、印度尼西亞-1(ISA-1)、印度尼西亞-2 (ISA-2)、東非-1 (EA-1)、東非-2 (EA-2)、東非-3 (EA-3)、西非拓?fù)湫?WA)[2]。我國(guó)毗鄰的東南亞、南亞地區(qū)O型病毒變異頻繁，存在病原生物多樣性[3,4]，區(qū)域內(nèi)FMD流行處于流行毒株多元化時(shí)期，不同血清型、不同遺傳譜系、不同進(jìn)化階段的病毒混雜存在，各自循環(huán)，形成了復(fù)雜難解的防控局面[5-7]。

預(yù)防、控制和消滅FMD是我國(guó)獸醫(yī)研究的重大課題，其中研發(fā)口蹄疫的快速診斷、定型技術(shù)具有十分重要的臨床意義。單克隆抗體(monoclone antibody, mAb)能夠識(shí)別單一抗原位點(diǎn)，與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)。目前，國(guó)內(nèi)諸多具有代表性的研究制備了多種抗口蹄疫病毒的單克隆抗體，用于FMDV診斷定型、抗體水平監(jiān)測(cè)、疫苗免疫動(dòng)物與自然感染的鑒別診斷、抗原表位分析等方面[8-14]。

為建立FMDV檢測(cè)方法，本研究用純化的O型兔化弱毒FMDV云南太保株(Yunnan Taibao attenuated strain, YNTBa)作為抗原，制備了1株O型FMDV的特異性mAb，分析了其生物學(xué)特性，為O型FMDV的診斷及其抗原位點(diǎn)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑

HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG、弗氏完全和弗氏不完全佐劑、PEG(Mw，1500和6000)、HAT(50×)、HT(50×)選擇培養(yǎng)基均購自Sigma公司；IMDM高糖培養(yǎng)基和優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)為GIBCO公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為分析純；免疫球蛋白標(biāo)準(zhǔn)亞類鑒定試劑盒購于RoChe公司。

1.1.2細(xì)胞、毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BHK-21細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室凍存；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由昆明海關(guān)動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供；BALB/c小鼠購于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；O型FMDV兔化弱毒云南太保株(YNTBa)適應(yīng)于BHK-21細(xì)胞備用，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1FMDV抗原制備

將YNTBa病毒(毒價(jià)為10-5.6TCID50/0.1 mL)按照MOI=0.01 TCID50劑量接種長(zhǎng)滿單層的BHK-21細(xì)胞，于37℃、5% CO2培養(yǎng)16～18h后出現(xiàn)CPE，收集病變細(xì)胞，凍融2次，4℃、9000r/min離心1 h，收取上清用BEI滅活處理；滅活液按照比例加入80g/L PEG-6000和40g/L NaCl，4℃攪拌并放置12h; 次日4℃ 9000r/min 離心90min，回收沉淀，用NTE緩沖液重懸，然后4℃、29000r/min離心2h，棄上清；沉淀用NTE緩沖液浸泡，4℃過夜，次日重懸，充分混合均勻分裝，-70℃凍存?zhèn)溆?。?jīng)PEG-6000沉淀純化病毒，測(cè)定蛋白含量，作為小鼠免疫抗原和ELISA包被抗原。

1.2.2間接ELISA檢測(cè)方法的建立

間接ELISA方法，采用方陣滴定法確定純化YNTBa抗原和抗體的最適工作濃度；用包被液按1∶50倍比稀釋抗原，包被酶標(biāo)板；BALB/c小鼠陽性血清和陰性血清均做倍比稀釋，同時(shí)設(shè)立骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和空白對(duì)照；酶標(biāo)二抗工作濃度1∶5000，TMB顯色后置于450 nm處讀取吸光值，P/N值最大的抗原稀釋度為最適濃度。

1.2.3動(dòng)物免疫

取純化的YNTBa病毒抗原免疫BALB/c小鼠。首次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原，按0.5mL/只(含抗原量50μg)皮下多點(diǎn)注射；間隔2周后，第2次免疫，用弗氏不完全佐劑乳化抗原，劑量途徑同上；間隔2周，第3次免疫，不加佐劑，劑量同上，腹腔注射。2周后尾部采血，分離血清，測(cè)定免疫小鼠血清抗體水平效價(jià)。取抗體效價(jià)最高的小鼠于融合前3d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，腹腔注射純化抗原，劑量100μg/只。

1.2.4細(xì)胞融合

加強(qiáng)免疫前1d，取正常BALB/c雌鼠腹腔細(xì)胞，按照常規(guī)方法制備飼養(yǎng)層細(xì)胞。加強(qiáng)免疫3d后，取血清效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞按6∶1的比例混合，按照常規(guī)方法進(jìn)行融合后，加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，放置于含5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。第2天用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行半數(shù)換液，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)10d左右完全更換HT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞孔適時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)移并擴(kuò)大培養(yǎng)，采用間接ELISA和IFA方法檢測(cè)抗體，陽性孔適時(shí)進(jìn)行亞克隆，直到獲得分泌穩(wěn)定的特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株[13]。

1.2.5單克隆抗體腹水的制備及純化

將0.5mL的滅菌液狀石蠟注射到10～12周齡小鼠腹腔，1周后，按1×106/只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7～10d后，抽取腹部極度膨脹小鼠腹水， 37℃ 2～4h，隨后置4℃過夜，次日10000r/min 離心10min取上清，用ELISA方法檢測(cè)效價(jià)，再采用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行提純，-70℃分裝保存。

1.2.6單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定

用間接 ELISA 方法測(cè)定，細(xì)胞培養(yǎng)上清與腹水分別進(jìn)行倍比稀釋，同時(shí)分別以 SP2/0 細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為對(duì)照。

1.2.7單克隆抗體亞類鑒定

按照抗體亞類鑒定試劑盒說明書，對(duì)所獲得的單克隆抗體進(jìn)行抗體亞類鑒定。

1.2.8Western-blot分析

按照常規(guī)方法，將純化的YNTBa病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印后用含5%脫脂乳的PBS 37℃封閉1h，用TBST充分洗滌后加入1∶1000倍稀釋的腹水單克隆抗體37℃搖床作用10min，4℃過夜，充分洗滌3次后加入1∶5000倍稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，37℃作用40min，洗滌3次后用DAB顯色。

1.2.9單克隆抗體相對(duì)親和力測(cè)定

采用NaSCN洗脫法測(cè)定mAb的相對(duì)親和力，用間隔0.5mol/L連續(xù)濃度的NaSCN分別對(duì)腹水上清和SP2/0腹水上清與抗原形成的復(fù)合物進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫后抗體與抗原反應(yīng)的OD450值。當(dāng)OD450值下降到不經(jīng)洗脫時(shí)的50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的NaSCN濃度即為抗體的相對(duì)親和力常數(shù)，以mol/L表示。

1.2.10單克隆抗體型特異性鑒定

采用IFA方法檢測(cè)，按本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行[15]。用O型的YNTBa病毒和A型FMDV毒株感染BHK-21細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，用冰冷無水乙醇固定10min，晾干后加入待檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清。37℃作用40min，PBS洗滌后加入羊抗鼠FITC標(biāo)記的IgG，37℃、40min，PBS洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.11單克隆抗體中和特性測(cè)定

按照常規(guī)病毒中和試驗(yàn)進(jìn)行，96孔微量板中加入50μL純化單克隆抗體，進(jìn)行10倍連續(xù)倍比稀釋，每個(gè)稀釋度4孔；上述各孔中加入100 TCID50的YNTBa病毒50μL混合，37℃作用1h, 接種長(zhǎng)滿單層BHK-21細(xì)胞的96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察CPE。同時(shí)設(shè)立陽性、陰性血清對(duì)照、病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 抗原制備及小鼠免疫

BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)收獲YNTBa病毒，經(jīng)差速離心、PEG-6000沉淀純化抗原，制備獲得病毒抗原。按照免疫程序，經(jīng)3次免疫后的5只BALB/c小鼠間接ELISA測(cè)定血清效價(jià)。結(jié)果顯示：5只小鼠血清效價(jià)≥10-4稀釋度中，4號(hào)和5號(hào)小鼠較其他小鼠高，首選為試驗(yàn)用鼠(圖1)。

圖1 小鼠血清10-4稀釋抗體效價(jià)

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立

免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0雜交瘤細(xì)胞按6∶1的比例混合融合，分散于10塊96孔板中培養(yǎng)；雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞上清對(duì)YNTBa抗原與小鼠陰性血清、SP2/0細(xì)胞上清對(duì)YNTBa抗原OD值之比均大于2.1，判為陽性雜交瘤細(xì)胞。再經(jīng)篩選及3次有限稀釋法克隆，結(jié)果獲得1株穩(wěn)定分泌抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，命名為9B3。

2.3 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水抗體效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水抗體效價(jià)，將其分別進(jìn)行倍比稀釋，測(cè)定OD450值；同時(shí)設(shè)立陽性、陰性血清對(duì)照。檢測(cè)樣品與陰性血清的OD450值(P/N)之比大于2.1時(shí)的mAb最大稀釋度確定為其ELISA效價(jià)。結(jié)果顯示：9B3雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清效價(jià)為1∶25 600，腹水效價(jià)為1∶106。

2.4 單克隆抗體亞類鑒定

對(duì)獲得的9B3單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示，此9B3單克隆抗體的重鏈類型為IgG2a, 輕鏈類型為κ(圖2)。

圖2 單抗亞型鑒定圖

2.5 Western-blot分析

用純化的YNTBa抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在電轉(zhuǎn)印至PDVF膜上進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示：9B3單克隆抗體與O型FMDV YNTBa病毒無特異性條帶，表明該單抗所針對(duì)的抗原位點(diǎn)為空間構(gòu)象表位。

2.6 單克隆抗體的相對(duì)親和力

分別用連續(xù)間隔0.5mol/L的不同濃度NaSCN對(duì)單抗9B3和SP2/0腹水進(jìn)行洗脫，經(jīng)測(cè)定9B3單克隆抗體的相對(duì)親和力指數(shù)為1.0mol/L(圖3)，表明9B3單抗具有中等強(qiáng)度的親和力。

圖 3 單抗9B3的相對(duì)親和力指數(shù)測(cè)定結(jié)果

2.7 單克隆抗體血清型特異性鑒定

將9B3單克隆抗體分別作用于感染O型FMDV YNTBa病毒和A 型FMDV的BHK-21細(xì)胞，進(jìn)行IFA檢測(cè)。結(jié)果顯示：9B3對(duì)YNTBa可以產(chǎn)生特異性熒光，而與A型FMDV不產(chǎn)生熒光反應(yīng)(圖4)。表明9B3單克隆抗體只針對(duì)O型FMDV起反應(yīng)，具有病毒型特異性。

A：感染O型FMDV的BHK-21細(xì)胞與mAb 9B3的反應(yīng)結(jié)果；B：感染A型FMDV的BHK-21細(xì)胞與mAb 9B3的反應(yīng)結(jié)果。

2.8 單克隆抗體中和特性的檢測(cè)

運(yùn)用微量病毒中和試驗(yàn)鑒定9B3單克隆抗體的中和活性，對(duì)照陽性血清中和效價(jià)≥1∶32判為陽性，<1∶32判為陰性。結(jié)果顯示：O型FMDV陽性血清、空白、細(xì)胞和病毒對(duì)照均成立，此單克隆抗體中和性>1∶32，表明9B3不具備中和活性。

3 討論

試驗(yàn)研究的目的是制備抗O型FMDV的特異性mAb，期望篩選出具有型特異性、識(shí)別譜廣、能夠用于開發(fā)檢測(cè)O型FMDV抗體的ELISA試劑盒。單抗制備免疫原O型FMDV兔化弱毒YNTBa病毒，來源于1958年云南保山地區(qū)流行的牛O型FMDV分離株，牛源強(qiáng)毒經(jīng)適應(yīng)3～5日齡乳兔后，連續(xù)傳代480代次以上，對(duì)牛源宿主毒力減弱，后再次適應(yīng)BHK-21細(xì)胞[16]。YNTBa毒株全基因序列(GenBank No. KY072818)分析顯示該毒株屬于O型Cathay遺傳進(jìn)化系譜較早的流行毒株[17]，與后期流行的O型Cathay系譜毒株的致病宿主與抗原差異明顯[2]。本文選擇制備該毒株單抗，還有用于分析該遺傳系譜毒株遺傳進(jìn)化抗原識(shí)別位點(diǎn)變異加劇趨勢(shì)的研究。同時(shí)，該毒株具有良好的免疫原性，免疫小鼠能夠獲得高的抗體效價(jià)(圖1)，保證免疫小鼠與雜交瘤細(xì)胞融合，獲得陽性分離株。同時(shí)，在制備過程中發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞合適的比例融合，也是成功獲得雜交瘤細(xì)胞的關(guān)鍵點(diǎn)。

試驗(yàn)獲得1株抗O型FMDV的mAb 9B3，IFA試驗(yàn)結(jié)果表明其具有型特異性(圖4)，推測(cè)其識(shí)別的抗原位點(diǎn)位于FMDV的衣殼蛋白上。但是病毒中和試驗(yàn)表明該單抗不具有中和活性，而且根據(jù)Western-blot結(jié)果分析，9B3結(jié)合的位點(diǎn)屬于空間構(gòu)想表位。FMDV mAb結(jié)合表位的保守性是其作為診斷試劑、選擇合適mAb的重要因素，下一步深入分析FMDV mAb 9B3識(shí)別的抗原位點(diǎn)，對(duì)于評(píng)估其作為廣譜抗原識(shí)別位點(diǎn)、研發(fā)檢測(cè)ELISA試劑具有科學(xué)意義。此外，本文尚不能確定該單抗識(shí)別不同O型FMDV遺傳系譜毒株的能力，特別是近年主要流行的SEA、ME-SA(含泛亞-1和泛亞-2)拓?fù)湫偷淖R(shí)別能力，有必要針對(duì)不同流行毒株制備不同批次單克隆抗體，研究其識(shí)別的不同免疫優(yōu)勢(shì)位點(diǎn)，增加基于單抗建立血清學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度。

試驗(yàn)制備獲得1株針對(duì)O型FMDV的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株9B3；該單抗屬于IgG2a/κ亞類，具有FMDV血清型特異性、不具有病毒中和活性，識(shí)別非線性的抗原表位。該單抗為O型FMDV抗原表位研究及檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。