萬 敏，邵 銳

(1.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237)

維生素D作為一種類固醇激素在維持動物體內(nèi)鈣磷代謝穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。維生素D的主要形式包括維生素D2(VD2，麥角鈣化醇)和維生素D3(VD3，膽鈣化醇)；前者主要存在于植物中，后者是動物體內(nèi)的主要存在形式。VD3可以通過動物皮膚中7-脫氫膽固醇經(jīng)陽光中紫外線照射形成，也可以通過食物獲??；而動物體內(nèi)的VD3可被代謝轉(zhuǎn)變?yōu)?5-羥基維生素D3[25(OH)D3]以及1α, 25-二羥基維生素D3[1α, 25(OH)2D3]。最初的研究顯示VD具有預(yù)防佝僂病的作用，近些年越來越多的研究表明VD除了傳統(tǒng)已知的調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷吸收以及骨質(zhì)礦化的作用以外，還具有十分廣泛的生理學(xué)作用，包括調(diào)控免疫系統(tǒng)、抗炎抗感染、抵御癌癥、調(diào)節(jié)營養(yǎng)代謝以及腸道菌群等功能[1-2]。已有的研究表明VD主要通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮其廣泛的生理學(xué)功能。

與高等動物相比，魚體內(nèi)VD3的代謝調(diào)控及其功能的研究相對較少。本文總結(jié)了動物體內(nèi)VD3的來源以及不同魚類VD的需求量，同時重點(diǎn)比較了魚類和高等動物對于VD3的來源、代謝以及VDR的差異，并概述了VD3對于魚類生理功能調(diào)控的研究進(jìn)展。

1 維生素D3的來源

2 維生素D的需求量

Barnett等以虹鱒為研究對象，于1979年首次證明了魚類飼料中添加VD的重要性[9]，而魚類VD缺乏癥表現(xiàn)為表皮層變薄、底層肌肉組織壞死以及血鈣濃度明顯降低等[10]。根據(jù)美國科學(xué)院國家研究委員會(NRC)在2011發(fā)布的水產(chǎn)動物營養(yǎng)需求量，不同魚類的VD營養(yǎng)需求量有很大的差異。重要的淡水養(yǎng)殖魚類羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)以及虹鱒達(dá)到最佳生長狀態(tài)時，其飼料中VD的最低添加量分別為360、500和1 600 IU/kg；而具有代表性的幾種海水魚類的VD最低需求量未見報道[11]。根據(jù)中國水產(chǎn)飼料行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，冷向軍總結(jié)了中國幾種常見養(yǎng)殖魚類(草魚、青魚、鯉魚、鯽魚、羅非魚和長吻鮠)配合飼料中維生素D推薦添加量為400～2 000 IU/kg[12]。

盡管大部分魚對過量的VD3表現(xiàn)出較高的耐受性，飼料中添加過量VD3并不會明顯影響魚體的生長指標(biāo)[13-14]。例如挪威食品安全局建議魚類，尤其是鮭科類，飼料中VD3含量的安全上限可達(dá)60 000 IU/kg(1.5 mg/kg)[14]。但是在其它魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，用添加過量VD3(200 000 IU/kg)的飼料投喂團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)3個月之后，其腸道和肝臟組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出不同程度的損傷，同時魚體的免疫功能及抗感染能力都明顯下降[15]。與此相似，當(dāng)飼料添加過量的VD3(200 000 IU/kg)或1α,25(OH)2D3(20 000 IU/kg)時，牙鲆(Paralichthysolivaceus)幼魚的死亡率及腹面色素沉著比例升高，脊柱畸形比例顯著增加[16]；而用含有過量VD3(≥19 200 IU/kg)的飼料投喂歐洲鱸(Dicentrachuslabrax)的幼魚也會嚴(yán)重影響魚體的骨質(zhì)礦化，并導(dǎo)致骨骼發(fā)育畸形，同時損傷其腸道發(fā)育及鈣吸收功能[17]。 因此歐洲食品安全局的動物飼料添加劑專責(zé)組設(shè)定魚類飼料中的VD3安全添加上限為3 000 IU/kg(0.075 mg/kg)[14]。

由于不同生活習(xí)性、不同食性以及不同生長階段的魚類對于維生素D需求量可能存在巨大的差異，而目前研究數(shù)據(jù)顯示的魚類最佳生長狀態(tài)時飼料中VD的添加量范圍也并不一定與其最佳免疫狀態(tài)的需求量吻合，因此在未來的研究中需要進(jìn)一步完善不同魚類在不同生長階段以及不同生理狀態(tài)下維生素D需求量的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。

3 維生素D3的代謝過程

維生素D的代謝過程具有較高的進(jìn)化保守性[20]。已有研究發(fā)現(xiàn)，魚類具有與高等動物相似的維生素D體內(nèi)代謝途徑以及維生素D代謝酶，但是兩者之間仍存在一定的差異。首先，高等動物中25(OH)D3被轉(zhuǎn)運(yùn)至腎臟進(jìn)行第二次羥基化，但是魚類的肝臟也具有1α-羥化酶活性，因此25(OH)D3也能在魚類的肝臟中進(jìn)行第二次羥基化[21-22]，而Graff等在檢測了不同魚種的不同組織器官中VD3代謝物的含量之后也推測VD3代謝的組織特異性在魚類中比人類要低[23]。其次，人類血液中25(OH)D3含量通常比1α,25(OH)2D3要高得多，血液25(OH)D3含量也是評價人體VD3含量的主要指標(biāo)，但是魚類血液中1α,25(OH)2D3是VD3代謝物的主要循環(huán)形式，其含量可達(dá)到人類血液中的幾倍甚至幾十倍[13]。此外，某些深海魚類的肝臟與脂肪組織中VD3的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陸地脊椎動物[4]。這些魚類肝臟與脂肪組織中的VD3大部分是以長鏈脂肪酸酯化的形式貯存，在正常情況下不會被分解代謝，而長鏈脂肪酸酯化VD3僅是哺乳動物組織中VD3非常小的組成部分[8]。

圖1 動物體內(nèi)維生素D3的代謝過程圖示

在高等動物中1α,25(OH)2D3的合成與代謝受到嚴(yán)格的調(diào)控，已有的研究發(fā)現(xiàn)血鈣濃度、甲狀旁腺激素(Parathyroid hormone, PTH)、成纖維細(xì)胞生長因子23(FGF23)以及1α,25(OH)2D3本身都能夠調(diào)節(jié)腎臟中CYP27B1的表達(dá)以及1α,25(OH)2D3的合成[1, 20]，而最近的研究結(jié)果闡明小鼠的腸道菌群通過影響FGF23的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)VD3代謝[24]。在魚類中有關(guān)VD3代謝調(diào)控的研究相對較少，早期以虹鱒以及銀鰻(Anguillaanguilla)為研究對象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水環(huán)境中的鈣離子濃度影響魚體內(nèi)VD3的代謝[25-26]；進(jìn)一步的研究也證實(shí)虹鱒肝臟和腎臟的VD3代謝能力在淡水和海水中表現(xiàn)出明顯的差異[27]。而最新發(fā)表的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)虹鱒在缺氧的條件下體內(nèi)CYP2R1和CYP27B1的基因表達(dá)顯著下降，從而導(dǎo)致維生素D代謝異常[28]。此外，皮質(zhì)醇也能夠調(diào)節(jié)斑馬魚(Daniorerio)體內(nèi)VD3代謝進(jìn)而促進(jìn)魚體的鈣吸收[29]。

在高等動物中腎臟合成1α,25(OH)2D3的能力隨著年齡的增長而逐漸下降[30]。與此相似，研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)超過3月齡達(dá)到性成熟之后斑馬魚肝臟中CYP2R1和CYP27B1的表達(dá)急劇降低，而CYP24A1的表達(dá)明顯升高，同時血清中的1α,25(OH)2D3含量顯著降低[31]。由于1α,25(OH)2D3調(diào)控動物體腸道鈣吸收，這些發(fā)現(xiàn)也部分解釋了與年齡相關(guān)的骨質(zhì)流失現(xiàn)象。

4 維生素D受體 (VDR)

維生素D3主要是通過其活性形式1α,25(OH)2D3與核受體VDR結(jié)合以完成其生理學(xué)功能。當(dāng)游離的1α,25(OH)2D3以自由擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞后，迅速與VDR結(jié)合形成復(fù)合物[32]。該復(fù)合物與維甲酸視黃醇X受體(RXR)形成異二聚體，VDR-RXR異二聚體可與目標(biāo)基因啟動子區(qū)域VDR反應(yīng)元件(VDRE)結(jié)合，調(diào)控其mRNA的轉(zhuǎn)錄[33](見圖2)。VDR不僅存在于與骨骼生長和維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的細(xì)胞中，在大多數(shù)組織細(xì)胞中均有分布[33]，這也間接表明了1α,25(OH)2D3具有廣泛的生理學(xué)作用。

圖2 維生素D受體(VDR)的作用機(jī)制

目前已經(jīng)測定VDR基因序列的魚種如下：比目魚 (Paralichthysolivaceus)、青鳉(Oryziaslatipes)、河豚(Takifugurubripes)、棘魚 (Gasterosteusaculeatus)、大西洋鮭(Salmosalar)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、歐洲鱸、斑馬魚和虹鱒等[34-36]。與哺乳動物只具有一個VDR不同，大多數(shù)魚類的VDR存在兩個亞型(VDRα和VDRβ)，兩者的基因與蛋白質(zhì)序列極為相似，但通常分布于不同的組織器官中[34, 37-38]。在斑馬魚中的研究結(jié)果顯示幾乎在所有不同的組織中都能檢測到VDRα的基因表達(dá)，但是VDRβ基因僅僅在肌肉和卵巢中高表達(dá)[31]。在對斑馬魚和青鳉中兩個VDR亞型進(jìn)行研究之后發(fā)現(xiàn)，盡管兩種魚的VDRα和VDRβ對1α,25(OH)2D3具有相似的親和力，但是VDRα與DNA結(jié)合能力顯著高于VDRβ，同時兩者對于轉(zhuǎn)錄輔因子的結(jié)合能力也有所不同，最終導(dǎo)致1α,25(OH)2D3與VDRα的結(jié)合表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)[35]。此外，當(dāng)斑馬魚VDRα與1α,25(OH)2D3結(jié)合時的活性構(gòu)象與人源VDR活性構(gòu)象極為相似，因此推測VDRα基因很可能與高等動物的同源[39]。而對于斑馬魚VDR功能的研究也進(jìn)一步證實(shí)，VDRα主要與鈣磷代謝調(diào)節(jié)有關(guān)[40]，而VDRβ與心臟、內(nèi)耳等器官的發(fā)育密不可分[37, 41]。但是對于兩種VDR在魚體內(nèi)具體的分子作用機(jī)制仍需要更深入的研究。

5 維生素D3的生理功能

大量的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)VD3除了調(diào)節(jié)動物體內(nèi)鈣磷穩(wěn)態(tài)，還具有十分廣泛的生理學(xué)作用，尤其是VD3對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控已成為高等動物中相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在魚類的研究中，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法發(fā)現(xiàn)在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)飼料中添加不同含量VD3會對魚體生長代謝以及相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)產(chǎn)生廣泛的影響[42]；而水體中加入微量1α,25(OH)2D3也影響斑馬魚早期胚胎中千余種 RNA 的表達(dá)，包括編碼不同的轉(zhuǎn)錄因子、多肽激素以及多種與脂肪酸和氨基酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)的RNA[43]。此部分將小結(jié)VD3調(diào)控魚體鈣磷及骨質(zhì)代謝、免疫系統(tǒng)以及其它生理學(xué)功能的研究進(jìn)展。

5.1 維生素D3對鈣磷及骨質(zhì)代謝的影響

與高等動物相似，VD3也能夠調(diào)節(jié)魚體中鈣磷水平[13,44]。早期的研究結(jié)果表明VD3可以促進(jìn)胡鯰(Clariasbatrachus)[45]、鯉(Cyprinuscarpio)[46]、大西洋真鱈(Gadusmorhua)[47]和黃鱔(Monopterusalbus)[48]等不同魚種血鈣水平的升高。在斑馬魚中進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)1α,25(OH)2D3通過VDRα刺激上皮鈣通道(Epithelial calcium channel)基因表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體鈣離子的吸收以及血鈣水平的增加[40]。此外，鰓是魚類從環(huán)境中攝入Ca2+的重要器官之一，在很多硬骨魚類的鰓中均有VDR的表達(dá)[49-50]。與鈣離子不同的是，水體中磷含量通常很低，所以魚類主要從食物中攝取磷。已有的研究也報道了VD3提高美洲鰻(Anguillarostrata)[51]、刺鯰(Heteropneustesfossi-lis)[52]、胡鯰[45]和虹鱒[53]等血磷水平。腸道是動物體鈣磷吸收的重要場所，大量的研究也報道了魚類腸道高表達(dá)VDR[34,49]；而VD3也能夠調(diào)節(jié)美洲鰻腎臟對磷的再吸收[54]。近幾年的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加適量的VD3可以提高黃顙魚腸道和腎臟中磷轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC34基因的表達(dá)，從而促進(jìn)魚體內(nèi)磷的吸收利用[55]。維生素D3對魚類骨質(zhì)礦化和代謝的影響也有諸多報道，例如腹腔注射VD3能有效提高南極巖鱈魚(Pagotheniabernacchii)的骨質(zhì)礦化[56]，而水體添加VD3也增強(qiáng)斑馬魚幼魚的骨質(zhì)礦化[57]。此外，VD3也能夠直接影響金鯽魚(Carassiusauratus)成骨細(xì)胞的生成及活性[58]。

5.2 維生素D3 對免疫功能的影響

在魚類中的研究表明VD3影響魚類免疫系統(tǒng)及其抗菌能力。在大西洋鯛(SparusaurataL.)的投喂飼料中添加適量VD3可以顯著提高頭腎免疫細(xì)胞的吞噬能力和血清過氧化氫酶水平，但是對于血清補(bǔ)體活性以及白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性等免疫指標(biāo)無顯著差異[72]，而最近的一篇研究報道發(fā)現(xiàn)VD3能夠提高大西洋鮭原代巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞趨化因子2(leukocyte-derivedchemotaxin2)的基因表達(dá)，同時VD3與巨噬細(xì)胞共孵育可降低沙門氏菌對巨噬細(xì)胞的粘附，從而提高巨噬細(xì)胞的抗菌能力[73]。

以建鯉(Cyprinuscarpiovar. Jian)原代腸細(xì)胞為研究對象的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1α,25(OH)2D3能有效抑制由脂多糖(LPS)激活的Toll樣受體4(TLR4)-髓樣分化初級應(yīng)答基因88(MyD88)信號通路，進(jìn)一步動物學(xué)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了VD3的抗炎作用，并能有效保護(hù)由LPS所導(dǎo)致的腸道損傷[74]。與此相似，在黃顙魚中的研究也證明了VD3的抗炎作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VD3可通過抑制脾臟中NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)感染后所引起的魚體固有免疫反應(yīng)，包括下調(diào)促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等[75]。此外，免疫細(xì)胞膜上的主要組織相容性復(fù)合體(Major Histocompatibility Complex, MHC)可與抗原結(jié)合, 并呈遞給T淋巴細(xì)胞, 從而激發(fā)機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)。近年的一篇研究報道顯示飼料中添加適量VD3顯著誘導(dǎo)黃顙魚小腸及腎臟中MHCclassII基因的上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體抵抗致病菌的侵入[76]。

與高等動物相似，VD3也能夠提高魚體內(nèi)抗菌肽的表達(dá)。黎德兵等發(fā)現(xiàn)在飼料中添加 500 IU /kg VD3可顯著提高黃鱔肝胰臟和頭腎中魚類抗菌肽鐵調(diào)素(Hepcidin)的表達(dá)量[77]；Dioguardi等的研究顯示VD3也能夠增強(qiáng)歐洲鱸腸道中抗菌肽鐵調(diào)素的基因表達(dá)，同時明顯提高腹腔巨噬細(xì)胞的噬菌能力[78]。而大鱗大麻哈魚(Oncorhynchustshawytscha)胚胎細(xì)胞系CHSE-214與20 nmol/L維生素D3共孵育72 h之后，細(xì)胞中抗菌肽cathelicidin-2基因表達(dá)以及細(xì)胞的抑菌能力顯著升高[79]。

總體而言，VD3對魚類免疫系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制仍然知之甚少，尤其是VD3對魚體適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的影響鮮有報道，而VD3對魚類免疫系統(tǒng)的調(diào)控是否存在有別于高等動物的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探究。

5.3 維生素D3的其他功能

維生素D3除了上述對鈣磷代謝、骨骼形成以及免疫功能的影響以外，在調(diào)控動物體的發(fā)育、組織再生、營養(yǎng)代謝、腸道菌群等不同方面具有廣泛而重要的作用。最近在斑馬魚中的研究發(fā)現(xiàn)VD3能夠促進(jìn)其心肌細(xì)胞增殖以及受損心臟的再生[80]；此外VD3也調(diào)節(jié)斑馬魚造血干細(xì)胞(HSPC)的體內(nèi)生成[81]。在高等動物中的研究表明1α,25(OH)2D3能夠作用于胰島β細(xì)胞，促使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及胰島素受體mRNA表達(dá)水平升高從而加速胰島素合成[82-83]，因此VD3缺乏與肥胖、高血糖及相關(guān)代謝綜合征緊密相關(guān)。與高等動物不同，魚類的胰島素分泌水平較低，因此魚類被認(rèn)為是先天的“糖尿病患者”，而能否通過補(bǔ)充VD3來影響魚體內(nèi)糖代謝這個科學(xué)問題仍有待更多的研究來回答。此外，VD3對動物體的脂肪代謝也產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠血液中載脂蛋白含量隨25(OH)D3濃度增加而增加[84]，而載脂蛋白對動物體內(nèi)膽固醇水平具有重要的調(diào)節(jié)作用[85]；同時鈣和1α,25(OH)2D3也可調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞中脂肪酸氧化，并抑制脂質(zhì)合成[86]。針對斑馬魚早期胚胎的轉(zhuǎn)錄組檢測結(jié)果顯示1α,25(OH)2D3調(diào)控發(fā)育早期斑馬魚中的脂肪酸代謝[43]，而Peng等通過敲除斑馬魚中CYP2R1基因阻斷斑馬魚體內(nèi)1α,25(OH)2D3合成，進(jìn)而導(dǎo)致成魚魚體出現(xiàn)明顯的脂肪堆積，同時也闡明了1α,25(OH)2D3通過線粒體生成的關(guān)鍵調(diào)控因子PGC-1α通路調(diào)節(jié)魚體的脂肪代謝[31]。

近幾年越來越多的研究結(jié)果揭示了VD3與腸道菌群的密切關(guān)聯(lián)。在高等動物中的研究顯示VDR基因突變對于腸道共生菌群具有顯著的影響，而利用維生素 D3代謝酶或者VDR基因敲除動物所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明維生素 D3信號通路的缺失導(dǎo)致腸道菌群的失衡，進(jìn)而誘發(fā)各種代謝疾病[87-88]；而另一方面，在無菌小鼠中VD3的代謝也顯著下降[24]。到目前為止在魚類中未見任何有關(guān)VD與腸道菌群互作關(guān)系的報道，本研究團(tuán)隊(duì)針對大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)的最新研究結(jié)果表明飼料中添加不同含量VD3對大菱鲆腸道菌群組成及多樣性有明顯的影響(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

6 研究展望

相較于高等動物，魚類中維生素D相關(guān)的研究尚處于起步階段，諸多方面的問題亟待更加深入的探究。根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，進(jìn)一步探查不同生活習(xí)性的魚類在VD來源以及代謝調(diào)控方面的差異，極有可能獲得一些重要的新發(fā)現(xiàn)，同時也有利于人類更好地利用魚類VD作為優(yōu)質(zhì)的VD來源。其次，在魚類中不僅VD內(nèi)分泌的調(diào)控機(jī)制需要更深入的研究，同時VD在魚類中能否如在高等動物中那樣通過旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮其生理作用也值得進(jìn)一步的驗(yàn)證。此外，前期的研究已表明VD3對魚類具有十分廣泛而重要的生理調(diào)控作用，因此探明VD3在魚類中未知的生理調(diào)控機(jī)制，尤其是在感染免疫、營養(yǎng)代謝、腸道菌群等方面將會是未來的研究熱點(diǎn)，這部分的研究內(nèi)容也將從比較生物學(xué)的角度為高等動物中的相關(guān)研究提供重要的參考。而深入分析魚類中兩種VDR亞型在這些生理過程中的作用機(jī)制將有助于進(jìn)一步了解VD對魚類生理功能的分子調(diào)控機(jī)理，并有可能發(fā)現(xiàn)有別于陸生高等動物的獨(dú)特之處。以上的這些研究內(nèi)容將深化人們對不同動物體如何獲取和利用VD的認(rèn)知，為魚類VD的精準(zhǔn)需求以及代謝調(diào)控提供理論指導(dǎo)，進(jìn)而在產(chǎn)業(yè)上優(yōu)化養(yǎng)殖魚類人工飼料的配制，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色健康的發(fā)展。