張 旭，陳 陽，嚴 霞，史曉鳳，馬 君

(中國海洋大學青島市光學光電子重點實驗室，山東 青島 266100)

果蔬農(nóng)藥殘留是食品安全一直存在且不可忽視的問題。倍硫磷是一種兼有接觸和內(nèi)吸性的廣譜、速效的殺蟲劑。多菌靈是一種廣譜性殺菌劑，對皮膚和眼睛有刺激，經(jīng)口中毒出現(xiàn)頭昏、惡心、嘔吐。這兩種農(nóng)藥也是果蔬中常用的殺蟲劑和殺菌劑，也是容易殘留和超標的農(nóng)藥。超標的農(nóng)藥殘留對人和動物危害極大[1]，還會造成環(huán)境污染[2]。目前國內(nèi)外農(nóng)藥殘留的檢測方法主要包括理化檢測法(色譜檢測技術(shù)及其聯(lián)用技術(shù)等)[3-4]和生物檢測技術(shù)(生物傳感器、酶聯(lián)免疫測定法、生物芯片等)[5]。這些方法各自存在不同的優(yōu)缺點而被局限于不同的檢測領域。

表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一種與粗糙金屬材料(如金、銀等)相關(guān)的表面增強效應，可使拉曼信號增強約1014～1015倍。因其靈敏度高、信息含量豐富，作為一種獨立的檢測手段被用于各方面的檢測中[6-7]。近年來，SERS技術(shù)也被廣泛用于農(nóng)藥殘留的檢測。2013年杜一平小組[8]應用GMA-EDMA多孔材料結(jié)合快速高靈敏SERS檢測方法，對兩種農(nóng)藥三環(huán)唑和百草枯的最低檢測濃度為5×10-3和1×10-3mg/L。2014年，Zhu Yiqun等[9]通過銀鏡反應制備了基于濾紙上沉積銀納米粒子(Ag NPs)的實用SERS基底，快速、便攜和準確地鑒定和檢測了果蔬表皮的福美雙和對氧磷農(nóng)藥殘留。2014年，Li Xiaozhou等[10]采用SERS技術(shù)檢測蘋果皮中磷酸鹽和倍硫磷的農(nóng)藥殘留，檢測極限分別為0.05和0.4 mg/L。2015年，Ma Chunhua等[11]應用SERS技術(shù)檢測茶葉中的多菌靈，SERS峰強和多菌靈濃度的線性范圍為0.5～8.0 mg/kg，檢測限為0.1 mg/kg，另外，研究發(fā)現(xiàn)茶葉上多菌靈的半衰期為4 d。2017年Chen Zhai等[12]應用SERS技術(shù)檢測蘋果樣品中啶蟲脒、毒死蜱和多菌靈的混合農(nóng)藥，它們的最低可檢測濃度分別為0.005 4，0.064和0.014 mg/kg。

目前，果蔬表皮農(nóng)藥殘留的快速、高靈敏度的現(xiàn)場檢測技術(shù)仍是研究的關(guān)鍵問題。本文以蘋果為例，以果蔬表皮常見的兩種農(nóng)藥——殺蟲劑倍硫磷和殺菌劑多菌靈為研究對象，應用GMA-EDMA多孔材料結(jié)合金納米顆粒制備的納米檢測棒，快速、無損檢測果蔬表皮兩種農(nóng)藥，探究兩種農(nóng)藥殘留在果蔬表皮的衰減規(guī)律，并對日常生活中常用的清洗方式的效果進行了比對研究。

1 實驗

1.1 實驗儀器和材料

實驗儀器：Ocean Optics 公司的便攜式QE65000系列拉曼光譜儀，分辨率為6 cm-1，光譜范圍0～1 800 cm-1；上海熙隆光電科技有限公司生產(chǎn)的FC-785-500-MM型窄線寬半導體激光器，激發(fā)波長為785 nm，激光器耦合入光纖的功率可調(diào)，最大為500 mW；InPhotonics公司生產(chǎn)的785 nm RPB型號的Y形反射式光纖探頭；日立集團的S4800掃描電子顯微鏡。

實驗試劑：檸檬酸三鈉、氯金酸(HAuCl4· 4H20)、甲醇、乙醇均購于國藥集團化學試劑有限公司，倍硫磷、多菌靈購于阿拉丁試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

實驗樣品：從市場購買的新鮮富士蘋果。

1.2 樣品的制備

倍硫磷與多菌靈均難溶于水，配制標準液時，先用乙醇配制成0.1 g/L的標準液，再用超純水稀釋成0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0和6.0 mg/L等不同濃度備用。購置的蘋果先用清水充分沖洗，再用超純水沖洗，自然晾干后，用記號筆在蘋果表面標記出1 cm2的區(qū)域，分別取200 μL不同濃度的倍硫磷、多菌靈溶液滴加到不同的標記區(qū)域內(nèi)，放置在陰涼通風處，自然晾干待用。

1.3 納米檢測棒的制備

納米檢測棒分為兩部分：金納米顆粒直接涂于待測蘋果表面，吸附殘留農(nóng)藥，滴加微量NaCl使金納米顆粒聚集；多孔材料再將金納米顆粒吸附于表面，由于毛細作用，該多孔材料具有良好的吸水性，在檢測蘋果表皮農(nóng)藥殘留時，可以將探測物吸附在多孔材料表面，并直接在其表面進行SERS探測，使SERS探測更加方便、靈敏度更高。

金納米顆粒的制備參考Frens法[13]，以檸檬酸鈉作為還原劑加熱還原氯金酸，制備好的金納米顆粒呈紫紅色，冷卻待用。

GMA-EDMA多孔材料的制備參考Frantisek Svec的方法[14-15]，通過原位聚合反應得到GMA-EDMA多孔材料。制備過程如下，首先將單體GMA、交聯(lián)劑EDMA、制孔劑環(huán)己醇和十二醇按一定體積比(VGMA∶VEDMA∶V環(huán)己醇∶V十二醇為15∶15∶49∶21)混合，再加入一定量的AIBN作為熱引發(fā)劑，AIBN占GMA與EDMA混合物質(zhì)量比的1.15%，將混合溶液充分混勻。將適量混合溶液加入到容量為5 mL的塑料模具中，通氮氣以充分排空混合溶液以及模具中的氧氣，迅速將模具密封并置入恒溫箱中65 ℃下反應12 h。反應完成后，分別以10倍柱體積無水乙醇和10倍柱體積超純水沖洗殘留制孔劑，最終得到的GMA-EDMA多孔材料為白色柱狀固體，存儲備用。

1.4 蘋果表皮農(nóng)藥的SERS探測

應用納米檢測棒檢測蘋果表皮農(nóng)藥殘留過程如圖1所示，取100 μL金納米顆粒均勻滴加在蘋果表皮標記區(qū)域內(nèi)，覆蓋整個標記區(qū)域，靜置1 min使表面農(nóng)藥與金納米顆粒充分吸附，滴加微量NaCl溶液使吸附了農(nóng)藥的金納米顆粒聚集，隨后用GMA-EDMA多孔材料將混合溶液吸附在其表面進行SERS探測。作為對照，蘋果表皮無農(nóng)藥殘留區(qū)域的SERS光譜也通過相同的實驗方法獲得。

圖1 蘋果表皮農(nóng)藥殘留快速檢測示意圖

探測倍硫磷時到達樣品表面的激光功率30 mW，積分時間10 s；由于多菌靈在溫度高于215 ℃時升華，探測多菌靈時到達樣品表面的激光功率10 mW，積分時間15 s，分別在樣品表面5個不同位置采集光譜，每個位置采集5次。并用Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米檢測棒的增強效果

2.1.1 增強效果 通過掃描電子顯微鏡對納米檢測棒進行表征(見圖2)。金納米顆粒的平均粒徑為57 nm 左右。多孔材料的孔結(jié)構(gòu)由小顆粒連接形成的微孔以及團簇之間的大孔組成，大孔主要起傳質(zhì)作用，能有效降低柱壓，微孔可以將金納米顆粒固定在三維表面，且形成合適的間距，促使更多“熱點”的形成[8]，有效的提高SERS靈敏度。

圖2 納米檢測棒掃描電鏡圖

以1 mg/L的多菌靈為探針分子，對比納米檢測棒和金納米顆粒的增強效果(見圖3)。滴加微量NaCl溶液于金納米顆粒與農(nóng)藥的混合溶液中，SERS信號有了一個數(shù)量級以上的提高(見圖3中b和c)；再以納米檢測棒吸附一定量上述混合溶液，SERS信號進一步增強約15倍(見圖3中a和b)。產(chǎn)生增強的原因為NaCl溶液的加入改變了金納米顆粒的聚集狀態(tài)，使得納米顆粒間距變小，“熱點”效應更強；納米檢測棒中的GMA-EDMA多孔材料表面具有豐富的三維孔結(jié)構(gòu)，可以使金納米顆粒聚集在多孔材料表面，金納米顆粒一方面進一步提高了聚集狀態(tài)，另一方面形成三維結(jié)構(gòu)，從而形成更多的“熱點”。該納米檢測棒可以大幅提高僅以金納米顆粒為基底的增強效果，而且可以使SERS探測更加方便、靈敏度更高，可以用于蘋果表皮農(nóng)藥殘留的檢測。

(a：納米檢測棒，b：金納米顆粒+NaCl溶液，c: 金納米顆粒，d：空白。 a: Detection stick, b: Gold NPs+NaCl solution, c: Gold NPs, d: Blank.)

2.1.2 檢測靈敏度 進一步驗證納米檢測棒的最低檢測濃度，利用納米檢測棒檢測倍硫磷和多菌靈各濃度標準溶液的SERS譜，結(jié)果見圖4(a)和圖5(a)。

表1為倍硫磷和多菌靈SERS峰位及其振動模式歸屬[10-11]，這些特征峰可以作為兩種農(nóng)藥的“指紋”譜，在實際檢測中可以作為能否檢測出兩種農(nóng)藥的依據(jù)。

圖4(b)以倍硫磷的1 048和1 220 cm-1處的特征峰強度與溶液濃度做關(guān)系曲線，隨著濃度的增加，特征峰強度也在增加，濃度高于1.0 mg/L時，峰強隨濃度增加趨于緩慢，低于0.05 mg/L檢測不到信號，在低濃度(0.05～1.0 mg/L)范圍內(nèi)對拉曼峰強與濃度的關(guān)系做線性擬合，有良好的線性關(guān)系，線性回歸決定系數(shù)R2均為0.99。

表1 倍硫磷和多菌靈SERS峰歸屬

圖4 不同濃度倍硫磷SERS譜及擬合曲線

以納米檢測棒為基底檢測多菌靈各濃度SERS譜，以630和1 218 cm-1處的特征峰強度與溶液濃度做關(guān)系曲線(見圖5(b))。隨著濃度的增加，特征峰強度也在增加，濃度高于0.50 mg/L時，峰強隨濃度增加趨于緩慢，低于0.05 mg/L時檢測不到特征峰信號，在低濃度(0.05～0.50 mg/L)范圍內(nèi)對拉曼峰強與濃度的關(guān)系做線性擬合，有良好的線性關(guān)系，線性回歸決定系數(shù)R2均為0.99。

結(jié)果表明以納米檢測棒為基底對倍硫磷和多菌靈的最低檢測濃度可達0.05 mg/L，且在低濃度范圍內(nèi)峰強與濃度均有良好的線性關(guān)系，可以為農(nóng)藥殘留定量檢測提供一種定量模型。該納米檢測棒靈敏度高，同時可以定量檢測農(nóng)藥殘留，能夠用于蘋果表皮農(nóng)藥殘留的檢測。

2.2 蘋果表皮農(nóng)藥殘留量的SERS檢測結(jié)果

取滴加了不同濃度農(nóng)藥的蘋果樣品，分別用納米檢測棒直接在蘋果表面進行檢測。滴加了不同濃度倍硫磷蘋果的檢測結(jié)果如圖6所示。蘋果表皮倍硫磷SERS譜中，濃度低至0.1 mg/L時，仍可以探測到1 048和1 220 cm-1處的SERS信號，低于0.1 mg/L檢測不到SERS信號，分別對特征峰強與濃度進行線性回歸，分析可得，倍硫磷在蘋果表皮殘留的最低檢測濃度為0.1 mg/L，在0.1～2.0 mg/L的濃度范圍內(nèi)拉曼峰強與濃度有良好的線性關(guān)系，可用于蘋果表面倍硫磷農(nóng)藥殘留定量分析的依據(jù)。

圖5 不同濃度多菌靈SERS譜及擬合曲線

蘋果表皮多菌靈的SERS譜見圖7。在濃度為0.05 mg/L時，630、1 262 cm-1處的特征峰依然可見。低于0.05 mg/L時檢測不到特征峰信號，拉曼特征峰強與濃度的關(guān)系，在低濃度范圍內(nèi)(0.05～0.5 mg/L)，濃度與峰強成線性關(guān)系，倍硫磷和多菌靈在蘋果表皮殘留濃度與峰強擬合曲線如表2所示。 在蘋果表皮檢測到的農(nóng)藥的濃度范圍與標準液檢測結(jié)果存在差異，主要原因是蘋果表皮的吸收以及農(nóng)藥干燥過程中的蒸發(fā)。

圖6 蘋果表皮倍硫磷SERS譜及擬合曲線

應用SERS技術(shù)，結(jié)合實驗室制備的檢測棒，可以實現(xiàn)蘋果表面農(nóng)藥殘留的快速、高靈敏并且無損的檢測。低濃度范圍內(nèi)，蘋果表皮殘留農(nóng)藥的濃度與拉曼峰強度均成良好的線性相關(guān)性。該方法無需復雜的樣品前處理過程，檢測時間只需數(shù)分鐘，可以對蘋果表皮的農(nóng)藥殘留進行定量分析，結(jié)合小型化便攜式拉曼光譜儀和集成化的拉曼探頭，可以為蘋果表皮農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測提供一種便捷方法。

2.3 蘋果表皮殘留農(nóng)藥去除方法比較結(jié)果

2.3.1 蘋果表皮的農(nóng)藥殘留量隨時間的衰減 探究蘋果表面農(nóng)藥殘留隨時間變化的關(guān)系，一方面可以分析噴灑農(nóng)藥后藥效持續(xù)時間，為農(nóng)藥噴灑周期提供指導，另一方面，為蘋果采摘前使用農(nóng)藥的安全間隔期提供依據(jù)。

圖7 蘋果表皮多菌靈SERS譜及擬合曲線

取200 μL濃度5.0 mg/L的農(nóng)藥滴加在不同蘋果上的標記區(qū)域內(nèi)，置于通風的環(huán)境中自然晾干，待表面晾干后選取一組蘋果進行表面農(nóng)藥殘留測定，之后每隔24 h選取另一組進行測定。

蘋果表皮農(nóng)藥殘留隨時間衰減變化如圖8所示，表3為對衰減變化的擬合曲線。分析可知，倍硫磷農(nóng)藥在蘋果表面的殘留隨時間的推移大致成指數(shù)衰減，大約1～2 d后特征峰強度衰減為e-1，即衰減時間常數(shù)為1～2 d；多菌靈隨時間衰減較慢，約4～5 d衰減為e-1，即衰減時間常數(shù)為4～5 d，之后趨于穩(wěn)定，一周以后仍可以探測到兩種農(nóng)藥微弱的SERS特征峰。倍硫磷衰減較快，主要原因可能是倍硫磷為乳油試劑，所配置的倍硫磷標準液由高濃度的倍硫磷乙醇溶液用純水稀釋得到，未添加其他乳化劑，隨著滴加在蘋果表皮溶液的蒸發(fā)倍硫磷也會有蒸發(fā)損失。印證了蘋果表皮檢測農(nóng)藥殘留時與純品檢測存在差異的原因。因此，實際噴灑的倍硫磷農(nóng)藥會添加乳化劑，以使得倍硫磷在蘋果表皮的藥效時間更長。雖然農(nóng)藥殘留會隨時間衰減，但是一段時間后衰減變緩，并趨于穩(wěn)定，說明農(nóng)藥殘留可以長期存在于蘋果表面，造成環(huán)境污染、食品污染等。因此，控制農(nóng)藥的用量以及蘋果入市前的禁藥期對食品安全問題尤為重要。農(nóng)藥使用說明書提到蘋果采摘前兩種農(nóng)藥的禁藥期為10～20 d，根據(jù)實驗所得農(nóng)藥衰減時間常數(shù)，該禁藥期時間是合理的。

2.3.2 蘋果表皮農(nóng)藥殘留不同清洗方式的效果 蘋果食用之前，能否清洗干凈蘋果表面的有害殘留是最受關(guān)注的問題，生活中常用的清洗劑有清水、淡鹽水、小蘇打水、果蔬洗滌劑等，本文分別針對這4種清洗方式的清洗效果以及清洗效率進行研究。將滴有農(nóng)藥的蘋果分別置于清水、1%淡鹽水、1%小蘇打水、0.5%果蔬洗滌劑中浸泡，每隔2～5 min選取一組蘋果進行農(nóng)藥殘留測定，最多浸泡20 min。分別作出不同清洗劑農(nóng)藥殘留隨浸泡時間的變化關(guān)系曲線，對比分析每種清洗劑的清洗效率以及最終清洗效果。為日常生活中果蔬的清洗提供指導。

圖8 蘋果表皮農(nóng)藥殘留隨時間衰減規(guī)律

表3 蘋果表皮農(nóng)藥殘留隨時間衰減擬合曲線

不同清洗劑對蘋果表皮農(nóng)藥殘留清洗效果如圖9所示。蘋果經(jīng)浸泡可以清洗掉大部分的農(nóng)藥殘留，隨浸泡時間的增長，大體成e指數(shù)衰減,相應的擬合曲線見表4。4種不同清洗劑對倍硫磷的清洗效果，衰減系數(shù)分別為：清水(5.3)、鹽水(0.7)、小蘇打水(1.3)、果蔬洗滌劑(1.9)。鹽水的清洗效果較好，清水清洗效果一般，表現(xiàn)為清洗效率較低，時間常數(shù)更長，超過5 min。對多菌靈的清洗效果與倍硫磷類似，清水清洗效果一般，時間常數(shù)大約24 min，鹽水和果蔬洗滌劑的清洗方式對多菌靈清洗效果顯著，時間常數(shù)在3 min左右。清水清洗效果不佳與這兩種農(nóng)藥在水中溶解度低有關(guān)，清水無法有效的將蘋果表皮農(nóng)藥殘留洗脫下來。綜合分析4種清洗劑對兩種農(nóng)藥的清洗效果可知，鹽水和果蔬洗滌劑能更快的將農(nóng)藥殘留洗脫下來，日常生活中購買的蘋果可利用鹽水或果蔬洗滌劑進行浸泡清洗，能有效去除農(nóng)藥殘留，由于果蔬洗滌劑也可能在蘋果表面殘留不易沖洗干凈，因此日常生活中可用淡鹽水浸泡10 min左右再用清水沖洗。僅用清水清洗效果較慢，但是20 min之后測得的農(nóng)藥殘留量與其他清洗劑最終清洗效果相當，可見只用清水浸泡清洗可以通過延長時間達到較好的清洗效果。

圖9 不同清洗劑對蘋果表皮農(nóng)藥殘留清洗效果

表4 不同清洗劑對蘋果表皮農(nóng)藥殘留清洗效果擬合曲線

3 結(jié)語

本研究提出了一種蘋果表皮農(nóng)藥殘留無損、快速檢測的方法，采用表面增強拉曼光譜技術(shù)結(jié)合納米檢測棒對蘋果表面殘留的倍硫磷和多菌靈農(nóng)藥進行了快速無損檢測。結(jié)果顯示，該方法檢測靈敏度高、方便快捷，對倍硫磷和多菌靈農(nóng)藥的檢測在低濃度范圍內(nèi)特征峰強度與濃度成良好的線性關(guān)系，可作為定量分析蘋果表皮農(nóng)藥殘留的參考。且蘋果表皮倍硫磷和多菌靈的最低檢測濃度分別為0.1和0.05 mg/L。

分析蘋果表皮倍硫磷和多菌靈農(nóng)藥殘留行為，殘留隨時間成e指數(shù)衰減，衰減時間常數(shù)分別為1～2 d和4～5 d。農(nóng)藥可長期殘留在表皮，因此蘋果食用前的清洗對人類健康尤為重要。使用納米檢測棒分別對4種清洗劑清洗效果進行檢測、分析，農(nóng)藥殘留隨浸泡時間的增長成e指數(shù)衰減，由于農(nóng)藥難溶于水，清水的清洗效果一般，需要增加浸泡時間，果蔬洗滌劑、淡鹽水對農(nóng)藥有良好的清洗效果。綜合考慮可食用性、清洗效果等因素，蘋果食用前可用淡鹽水浸泡10 min以上，再用清水沖洗，或者只用清水浸泡20 min以上，都能有效去除大部分農(nóng)藥殘留。