康 奎, 蔡永進(jìn), 張道偉, 龔 俊, 張文慶,*

(1. 遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 貴州省赤水河流域動物資源保護(hù)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州遵義 563002;2. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510275)

昆蟲在發(fā)育過程中所經(jīng)歷的外界營養(yǎng)狀態(tài)極大地影響著自身的生長和繁殖，而營養(yǎng)信號則是由體內(nèi)復(fù)雜的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行傳遞，其中類胰島素信號通路(insulin-like signaling pathway, IIS)和雷帕霉素靶標(biāo)(target of rapamycin, TOR)通路是在營養(yǎng)水平上調(diào)控生長和繁殖最為經(jīng)典的兩個信號通路，扮演著營養(yǎng)傳感器的角色(Koyamaetal., 2013; Smykal and Raikhel, 2015)。TOR是一種絲氨酸或蘇氨酸蛋白激酶，通過氨基酸與營養(yǎng)傳感相連，在營養(yǎng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵的作用(Howell and Manning, 2011; Loewith and Hall, 2011)。目前已鑒定出兩種不同的TOR復(fù)合物，TORC1和TORC2，其中只有TORC1是對營養(yǎng)敏感的(Kim and Guan, 2011; Lianetal., 2015)。TOR激酶能使真核生物翻譯起始因子的抑制蛋白4E結(jié)合蛋白(effector 4E-binding protein, 4EBP)失活，使得4EBP不能和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)mRNA翻譯(Roy and Raikhel, 2012)；另外，TOR激酶能夠活化核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase, S6K)，促使核糖體蛋白S6磷酸化，進(jìn)而啟動5′多嘧啶結(jié)構(gòu)的mRNA的翻譯過程，編碼相關(guān)核糖體蛋白和翻譯調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)mRNA蛋白翻譯過程(Hansenetal., 2005; Holzetal., 2005)。

IIS信號通路在昆蟲中同樣相對保守，其在組織營養(yǎng)感知和協(xié)調(diào)組織生長中有著十分重要的作用(Hietakangas and Cohen, 2009)。果蠅Drosophila中的研究表明，在營養(yǎng)條件較好的時候，胰島素分泌細(xì)胞產(chǎn)生類胰島素多肽(insulin-like peptides, ILPs)并分泌至血淋巴(Géminardetal., 2009)，而饑餓狀態(tài)則影響了IIS通路的活性(Brittonetal., 2002)，降低了果蠅類胰島素多肽(Drosophilainsulin-like peptide, DILP)基因DILP3和DILP5的轉(zhuǎn)錄水平(Ikeyaetal., 2002)，且阻止了ILPs從細(xì)胞中分泌出去(Géminardetal., 2009)。ILPs分泌到血淋巴后結(jié)合細(xì)胞上的胰島素受體(insulin receptor, InR)，InR通過一系列的磷酸化信號級聯(lián)激活下游蛋白激酶(protein kinase B, PKB)，隨后磷酸化叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O, FoxO)，進(jìn)而影響昆蟲的生長發(fā)育等生理活動(N?ssel and Vanden Broeck, 2016; 陳曉昂等, 2017)。此外，IIS通路中的主要效應(yīng)物AKT能夠通過抑制結(jié)節(jié)硬化復(fù)合體(tuberous sclerosis complexes, TSC)的負(fù)調(diào)節(jié)因子來激活TOR信號通路(Wullschlegeretal., 2006; Loewith and Hall, 2011)。

除了IIS和TOR信號通路之外，AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)也是高度保守的能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑，在相應(yīng)營養(yǎng)信號方面具有重要的調(diào)控作用。AMPK是一種異源三聚體復(fù)合物，由一個催化亞單位(α)和兩個調(diào)節(jié)亞單位(β和γ)組成，果蠅中每個亞單位都由一個基因編碼(Laws and Drummond-Barbosa, 2016)。在低能量水平下AMPK被激活，以控制許多細(xì)胞過程，包括代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞周期(Laws and Drummond-Barbosa, 2016)。此外研究表明，AMPK活性隨著細(xì)胞中AMP或ADP水平的升高(當(dāng)ATP水平較低時)以及上游激酶的激活而增加，激活的AMPK刺激分解代謝和抑制合成代謝過程，從而保持能量穩(wěn)態(tài)(Hardieetal., 2016)，這對于昆蟲的生長和繁殖具有重要意義。

保幼激素(juvenile hormones, JH)和20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)是兩種典型的昆蟲激素，它們與昆蟲的繁殖息息相關(guān)(Nijhoutetal., 2014; Royetal., 2018)。JH在昆蟲咽側(cè)體部位進(jìn)行合成，其主要作用是維持昆蟲幼蟲形態(tài)，阻止蛻皮激素所促進(jìn)的變態(tài)進(jìn)程，同時參與變態(tài)、繁殖、行為、滯育、壽命等生命過程的調(diào)節(jié)(Jindraetal., 2013)。而20E的直接作用則是調(diào)控昆蟲蛻皮的發(fā)生，并且同樣是重要的生殖調(diào)節(jié)劑(Raikheletal., 2005)。這兩種激素在不同昆蟲的生殖事件中所發(fā)揮的作用程度不盡相同，似乎在相對低等的昆蟲中以JH的調(diào)節(jié)為主，而在高級昆蟲中則以20E的調(diào)節(jié)為主(Bellés, 2004; Raikheletal., 2005; Royetal., 2018)。然而，這兩種激素的合成均受到了IIS, TOR以及AMPK信號通路的調(diào)控。因此，為了探究營養(yǎng)對褐飛虱Nilaparvatalugens體內(nèi)上述生長和繁殖信號通路的影響，本研究設(shè)計了3種不同營養(yǎng)濃度的人工飼料，分別飼喂褐飛虱，進(jìn)而檢測在不同營養(yǎng)條件下各個生長和繁殖信號通路相關(guān)基因表達(dá)的差異，最終完善營養(yǎng)調(diào)控褐飛虱生理的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

褐飛虱采集于廣東省韶關(guān)、肇慶、惠州、清遠(yuǎn)等地，并在實(shí)驗(yàn)室混合養(yǎng)殖近4年，飼養(yǎng)褐飛虱用的水稻為非抗性水稻品種黃華占。飼養(yǎng)條件為：溫度28±1℃，相對濕度80%～90%，光周期14L∶10D。取水稻上孵化出的3齡第2天若蟲用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2 褐飛虱不同濃度人工飼料的配制和飼喂

褐飛虱的全化學(xué)人工飼料D-97的配制方法參考Fu等(2001)，配好后用無菌水定容到100 mL，pH保持6.8。以全純?nèi)斯わ暳螪-97作為基本100%人工飼料，在此基礎(chǔ)上分別稀釋1倍作為50%濃度人工飼料，在50%濃度人工飼料再稀釋1倍作為25%濃度人工飼料，保持飼料中其他成分的比例和理化性質(zhì)不變，一共配制3種人工飼料。

挑選褐飛虱3齡第2天若蟲，放置于雙通玻璃管(4 cm×2 cm)中。在玻璃管兩端覆蓋一層Parafilm 膜，吸取40 μL人工飼料于膜上，加蓋一層Parafilm膜，使人工飼料夾在兩層膜之間，并用解剖針在兩端雙層Parafilm膜上均勻刺出4個小孔，手指輕輕按壓使膜中的人工飼料均勻分散。此外，為了保證褐飛虱取食，用黑色塑料膜包裹雙通玻璃管中間部分，露出兩端，利用褐飛虱趨光性的特點(diǎn)使其取食人工飼料。以飼喂100%濃度人工飼料的組別為對照組，而以分別飼喂50%和25%濃度人工飼料的組別為處理組。

1.3 褐飛虱生長發(fā)育指標(biāo)統(tǒng)計

按照人工飼料飼喂褐飛虱的方法，每管中放入3齡第2天若蟲20頭，每個濃度人工飼料飼喂5管，記錄每天的存活情況至成蟲羽化后第2天，并對5齡第2天若蟲和羽化后第2天成蟲進(jìn)行體重稱量，統(tǒng)計3齡第2天若蟲發(fā)育至羽化后第2天成蟲的發(fā)育歷期，并解剖羽化后第6天的雌成蟲卵巢統(tǒng)計每卵巢成熟卵量。

1.4 熒光定量PCR檢測IIS/TOR和AMPK通路相關(guān)基因的表達(dá)

在不同濃度人工飼料飼喂至成蟲羽化后第2天，后取15頭雌成蟲，在顯微解剖鏡下取得卵巢、脂肪體以及其他組織，按照Trizol(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)的說明書，利用Trizol法進(jìn)行總RNA的抽提。最后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并利用微量核酸蛋白測定儀NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 美國)檢測RNA的濃度以及純度。在檢測完RNA的質(zhì)量后，利用試劑盒Prime Script RT Reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, Kyoto, 日本)進(jìn)行cDNA第1鏈的合成。

在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索檢測基因的序列，并設(shè)計特異性熒光定量PCR引物(表1)，以β-actin基因作內(nèi)參基因，利用熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的相對表達(dá)量。熒光定量PCR反應(yīng)體系(33 μL): 正反向引物(10 μmol/L)各0.7 μL, KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2×) 16.5 μL，ddH2O 14.1 μL, 1 μL cDNA模板。將上述反應(yīng)液分裝到3個孔中，每孔10 μL，進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)?？偡磻?yīng)置LightCycler480熒光定量檢測儀上進(jìn)行，程序設(shè)置為: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性3 s, 60℃退火20 s, 40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)溶解曲線和擴(kuò)增曲線確定引物的準(zhǔn)確性，最終根據(jù)2-ΔΔCT法計算mRNA的相對水平(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.5 AKT, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平檢測

隨機(jī)取不同濃度飼料飼喂至羽化后第6天褐飛虱雌成蟲，在顯微解剖鏡下解剖取得卵巢以及其他組織，按照ProteinExt Mammalian Total Protein Extraction Kit試劑盒(全式金公司，北京)的說明書進(jìn)行總蛋白的提取。分別配制10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，取適量蛋白質(zhì)溶液(檢測AKT時蛋白上樣量為80 μg，檢測FoxO和AMPK時蛋白上樣量為30 μg)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后將SDS-PAGE膠取出進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后將膜浸泡在封閉緩沖液中孵育，用TBST緩沖液清洗3次，根據(jù)抗體的效價加入一抗(AKT, AMPK和FoxO磷酸化的效價均為1∶1 000，β-Acitn的效價為1∶4 000)，4℃過夜后再次用TBST緩沖液清洗4次，加入辣根過氧化物酶HRP 標(biāo)記的二抗(兔抗效價為1∶20 000，鼠抗效價為1∶10 000)，室溫孵育50 min后再次用TBST緩沖液清洗3次，最終用ECL顯影液進(jìn)行顯色。磷酸化水平的檢測使用不同位點(diǎn)的蛋白磷酸化抗體，AKT蛋白磷酸化的抗體位點(diǎn)為S473，AMPK蛋白磷酸化的抗體位點(diǎn)為T172，F(xiàn)oxO蛋白磷酸化的抗體位點(diǎn)為S253。

1.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的測定

為檢測蛋白中的ROS水平，取10 μg 1.5節(jié)中提取的卵巢、脂肪體和其他組織蛋白，加入CM-H2CFDA探針，至終濃度為10 μmol/L，測定體系終體積100 μL。加入到96孔酶標(biāo)板中。同時取100 μL帶有10 μmol/L探針的PBS，作為陰性對照。37℃避光靜置1 h后，在激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm條件下使用酶標(biāo)儀測定相對熒光數(shù)值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得1 μg蛋白中ROS水平。

1.7 20E和JH滴度的測定

分別在不同濃度人工飼料飼喂至4齡第2天若蟲、5齡第2天若蟲以及羽化后第2天成蟲后，取5 mg褐飛虱樣品于EP管中，液氮冷凍后在冰上研磨，加入700 μL 75%的甲醇溶液，12 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，而剩余沉淀則重新加入700 μL 75%的甲醇溶液，按照相同的離心操作重復(fù)3次獲得上清液，并將4次離心所得上清液進(jìn)行混合。隨后將上清液在濃縮儀濃縮至上清液完全蒸發(fā)，加入純甲醇溶液定容到100 μL，混勻后即制成為20E含量待測樣品，最終利用昆蟲蛻皮激素酶聯(lián)免疫試劑盒(雨彤，江蘇)檢測為20E滴度。

分別在不同濃度人工飼料飼喂至4齡第2天若蟲、5齡第2天若蟲以及羽化后第2天成蟲后，取10 mg褐飛虱樣品于EP管中，液氮冷凍后在冰上研磨，加入500 μL正己烷溶液，10 000×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管，而剩余的沉淀中重新加入500 μL正己烷溶液，按照相同的離心操作重復(fù)3次獲得上清液，并將4次離心所得上清液進(jìn)行混合。隨后將上清液在濃縮儀濃縮至上清液完全蒸發(fā)，加入純甲醇溶液定容到25 μL，混勻后即制成為JH含量待測樣品，最終使用昆蟲保幼激素酶聯(lián)免疫試劑盒(雨彤，江蘇)檢測JH滴度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用Duncan氏多重比較法進(jìn)行多組樣本間的差異顯著性分析，所有步驟均在軟件SPSS 17.0中進(jìn)行，作圖使用Excel 2007。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度人工飼料對褐飛虱生長發(fā)育的影響

用不同濃度人工飼料飼喂褐飛虱3齡第2天若蟲發(fā)育至羽化后第2天成蟲，在期間檢測褐飛虱的不同生理指標(biāo)。結(jié)果表明，隨著飼喂?jié)舛鹊慕档停诛w虱在飼喂至5齡第2天若蟲開始就出現(xiàn)體重顯著下降，一直持續(xù)至羽化后第2天成蟲(圖1: A)，發(fā)育到成蟲的所需的時間則顯著縮短(圖1: C)，存活率也是顯著降低(圖1: B)。對交配過的羽化后第6天雌成蟲的卵巢進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)隨著飼喂?jié)舛冉档推渎殉仓谐墒炻蚜５臄?shù)量隨之減少，25%濃度人工飼料飼喂條件下，其卵巢內(nèi)幾乎沒有成熟的卵粒(圖1: D)。

圖1 不同濃度人工飼料對褐飛虱生長發(fā)育的影響Fig. 1 Effects of the artificial diet of different concentrations on the growth and development of Nilaparvata lugens5N2D: 5齡第2天若蟲Day-2 5th instar nymph; 2D: 羽化后第2天成蟲2-day-old adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3);柱上不同字母代表差異顯著(P<0.05， Duncan氏多重比較法)。Data in the figure represent means±SE (n=3). Different lowercase letters above bars represent significant differences (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

2.2 取食不同濃度人工飼料褐飛虱成蟲不同組織中IIS/TOR以及AMPK通路相關(guān)基因的表達(dá)

用不同濃度人工飼料飼喂褐飛虱至成蟲羽化后第2天，通過熒光定量PCR檢測不同組織中IIS/TOR通路相關(guān)基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，IIS通路的起點(diǎn)胰島素受體基因InR1在卵巢中的表達(dá)量隨營養(yǎng)濃度的變化不大，在脂肪體中的表達(dá)量在飼喂?jié)舛葴p半后顯著下調(diào)(P<0.05)，但在飼喂?jié)舛壤^續(xù)下降至25%后又恢復(fù)了表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)量則隨著飼喂?jié)舛鹊慕档投@著降低(P<0.05)，且在飼喂?jié)舛冉档椭?5%后持續(xù)下調(diào)(圖2: A)；InR2的表達(dá)則無論是在卵巢、脂肪體還是其他組織中，都隨著飼喂?jié)舛鹊慕档投霈F(xiàn)下調(diào)，其中在其他組織中的表達(dá)與InR1的表達(dá)情況類似(圖2: B)。取食不同濃度人工飼料后，褐飛虱羽化后第2天若蟲脂肪體和其他組織中AKT基因的mRNA水平均出現(xiàn)了顯著性下調(diào)(P<0.05)，而在卵巢組織中，AKT基因的mRNA水平只在25%人工飼料飼喂條件下出現(xiàn)顯著下調(diào)，說明卵巢當(dāng)中AKT基因的表達(dá)對外界營養(yǎng)條件變化較不敏感(圖2: C)；FoxO基因的mRNA水平變化情況同InR1類似，而且在卵巢組織當(dāng)中，兩基因的mRNA水平似乎不受外界營養(yǎng)條件變化的影響，維持了穩(wěn)定的表達(dá)(圖2: A, D)。在TOR通路中，TOR,S6K和4EBP在3種組織中的mRNA水平(S6K在25%濃度飼料飼喂時的卵巢中除外)均隨著人工飼料飼喂?jié)舛鹊慕档投霈F(xiàn)了顯著性下調(diào)(P<0.05)，其中在其他組織中3個基因的mRNA水平對外界營養(yǎng)濃度變化較為敏感，隨著飼喂?jié)舛冗M(jìn)一步降低，基因mRNA水平的下調(diào)幅度亦進(jìn)一步加大(圖2: E-G)。 最后，飼喂低濃度人工飼料后AMPK亞基基因AMPKα在3種組織中,AMPKβ在其他組織中以及AMPKγ在脂肪體和其他組織中的mRNA水平均出現(xiàn)了顯著性下調(diào)(P<0.05)，其中AMPKα和AMPKβ的mRNA水平對外界營養(yǎng)濃度變化較為敏感，但是在卵巢組織中，AMPKγ的mRNA水平似乎不受外界營養(yǎng)濃度變化的影響，維持了較為穩(wěn)定的基因表達(dá)(圖2: H-J)。

2.3 取食不同濃度人工飼料褐飛虱成蟲卵巢和其他組織中Akt, FoxO和AMPK蛋白磷酸化水平

在成蟲羽化后第6天，取食不同濃度人工飼料的褐飛虱成蟲卵巢和其他組織中Akt, FoxO和AMPK的蛋白磷酸化水平進(jìn)行檢測。Western blotting結(jié)果表明：Akt, FoxO和AMPK蛋白的磷酸化水平在卵巢和其他組織隨著飼喂?jié)舛鹊慕档途尸F(xiàn)顯著上升的趨勢(圖3)。

圖2 取食不同濃度人工飼料羽化后第2天褐飛虱成蟲不同組織中IIS/TOR以及AMPK通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平Fig. 2 Relative mRNA expression levels of related genes involved in IIS/TOR and AMPK pathways in different tissuesof the 2-day-old adults of Nilaparvata lugens after fed with the artificial diet of different concentrationsA: InR1; B: InR2; C: AKT; D: FoxO; E: TOR; F: S6K; G: 4EBP; H: AMPKα; I: AMPKβ; J: AMPKγ. 以100%濃度人工飼料(全純?nèi)斯わ暳螪-97)作為對照。The artificial diet of 100% concentration (pure artificial diet D-97) was used as the control.

2.4 人工飼料濃度對褐飛虱成蟲不同組織中ROS水平的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證隨著人工飼料濃度的降低胰島素信號通路相關(guān)蛋白磷酸化水平在羽化后第6天褐飛虱成蟲各組織上升的原因，本研究檢測了卵巢、脂肪體和其他組織中的每微克蛋白中ROS水平。通過檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著人工飼料濃度的降低，各組織中的ROS水平均出現(xiàn)了顯著性上升(P<0.05)，并且外界營養(yǎng)濃度越低，組織中ROS水平越高(圖4)。

2.5 營養(yǎng)對不同齡期褐飛虱體內(nèi)20E和JH含量的影響

20E和JH是調(diào)控昆蟲發(fā)育、變態(tài)與繁殖最為重要的兩種激素，調(diào)節(jié)昆蟲的許多生理進(jìn)程和性狀，例如變態(tài)、行為、繁殖、滯育、壽命等。本研究通過檢測不同營養(yǎng)條件兩種激素的滴度，來探究營養(yǎng)是否調(diào)控兩種激素的合成來調(diào)控自身的生長發(fā)育。選擇褐飛虱蛻皮后第2天成蟲，生理狀態(tài)相對穩(wěn)定的條件下，檢測兩種激素的含量，結(jié)果表明：取食不同濃度人工飼料時褐飛虱4齡第2天若蟲中JH滴度沒有顯著差異(P>0.05)，在5齡第2天若蟲體內(nèi)隨著飼喂?jié)舛鹊慕档?，JH滴度呈現(xiàn)顯著下降趨勢, 隨后在羽化后第2天成蟲期顯著上升(P<0.05)(圖5: A)。而在褐飛虱4齡第2天若蟲到羽化后第2天成蟲發(fā)育階段之間，隨著人工飼料飼喂?jié)舛鹊慕档停?0E滴度均呈現(xiàn)顯著上升趨勢(P<0.05)(圖5: B)。

3 討論

當(dāng)昆蟲進(jìn)食人工飼料時，大量的營養(yǎng)物質(zhì)從腸道進(jìn)入它們的血液或血淋巴，并通過營養(yǎng)感應(yīng)途徑被體內(nèi)細(xì)胞檢測到。這些營養(yǎng)感知通路在昆蟲中高度保守，能夠幫助細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)濃度做出快速的反應(yīng)。研究表明，果蠅脂肪體中的TOR通路負(fù)責(zé)檢測氨基酸水平，通過未知途徑檢測其他大量營養(yǎng)物質(zhì)的水平，而所感知的營養(yǎng)狀態(tài)再由脂肪體傳遞到全身(Colombanietal., 2003; Géminardetal., 2009)。因此在果蠅Drosophila和褐飛虱等昆蟲中均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度控制著TOR通路靶點(diǎn)的活性(Colombanietal., 2003; Luetal., 2016)。在本研究中，當(dāng)飼喂?fàn)I養(yǎng)濃度下降時，顯著影響了褐飛虱的生長發(fā)育和繁殖(圖1)，TOR在褐飛虱羽化后第2天成蟲卵巢、脂肪體以及其他組織中的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(圖2: E)，表明低營養(yǎng)狀態(tài)抑制了TOR的活性。作為TOR的下游激活靶標(biāo)，氨基酸可以誘導(dǎo)S6K基因的表達(dá)(Luetal., 2016)，而本研究表明S6K在脂肪體和其他組織中的表達(dá)量相應(yīng)地隨著營養(yǎng)濃度的降低而下調(diào)(圖2: F)，這說明營養(yǎng)的不足阻礙了褐飛虱體內(nèi)mRNA蛋白翻譯過程。但值得注意的是，翻譯抑制因子基因4EBP的表達(dá)在各個組織中也存在顯著下調(diào)(圖2: G)，而在埃及伊蚊Aedesaegypti中，血液喂養(yǎng)使得4EBP過度磷酸化，翻譯抑制功能被減弱 (Roy and Raikhel, 2012)。這有可能表明TOR僅促使4EBP的磷酸化而非抑制其轉(zhuǎn)錄。

圖4 取食不同濃度人工飼料時羽化后第6天褐飛虱成蟲不同組織中的ROS水平Fig. 4 ROS levels in different tissues of the 6-day-old adults of Nilaparvata lugens after fed with the artificial diet of different concentrations

在TOR感知營養(yǎng)狀態(tài)后，脂肪體會相應(yīng)地分泌幾種肽信號調(diào)節(jié)對營養(yǎng)的系統(tǒng)反應(yīng)(Géminardetal., 2009; Rajan and Perrimon, 2012; Sanoetal., 2015; Agrawaletal., 2016; Delanoueetal., 2016)。果蠅腦中產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞是來自脂肪體的這些肽信號的主要目標(biāo)。在營養(yǎng)條件良好時，這些細(xì)胞產(chǎn)生并分泌3種果蠅類胰島素多肽(DILP2, DILP3和DILP5)到血淋巴中(Brogioloetal., 2001; Ikeyaetal., 2002)，即胰島素信號通路被激活；而在營養(yǎng)不良的情況下，這些肽被保留在產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞中(Géminardetal., 2009)。在我們的研究中，隨著人工飼料中營養(yǎng)濃度的下降，IIS通路中的關(guān)鍵基因InR2在褐飛虱羽化后第2天成蟲各個組織中的表達(dá)量均顯著下調(diào)，僅InR1,AKT和FoxO在卵巢中的表達(dá)對營養(yǎng)濃度的變化不敏感(圖2: A-D)，表明低營養(yǎng)濃度抑制了IIS通路的活性，這和之前的研究結(jié)果一致。但盡管AKT和FoxO在脂肪體和其他組織中的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降，它們在卵巢和其他組織中的磷酸化水平是隨營養(yǎng)濃度的降低而上升的(圖3: A-D)。在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中的研究顯示，AKT的高磷酸化水平激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來感知血液中的低葡萄糖，并增強(qiáng)大腦對其作為能源的吸收(Zhangetal., 2017)，因此AKT和FoxO的磷酸化水平上升一方面是由于IIS信號上升，另一方面可能是回應(yīng)代謝壓力。

圖5 取食不同濃度人工飼料時不同齡期褐飛虱體內(nèi)的保幼激素(A)和蛻皮激素(B)滴度Fig. 5 Titer levels of JH (A) and 20E (B) in Nilaparvata lugens at different developmental stages after fed with the artificial diet of different concentrations4N2D: 4齡第2天若蟲Day-2 4th instar nymph; 5N2D: 5齡第2天若蟲Day-2 5th instar nymph; 2D: 羽化后第2天成蟲2-day-old adult.

不同濃度人工飼料飼喂后，在各種信號通路調(diào)節(jié)下，最終影響了褐飛虱JH以及20E的合成。在低人工飼料濃度狀態(tài)下，JH的合成與褐飛虱的發(fā)育階段相關(guān)。在4齡第2天若蟲階段，JH滴度與人工飼料濃度的關(guān)系不大(圖5: A)；在5齡第2天若蟲時則隨著飼喂?jié)舛鹊南陆刀霈F(xiàn)JH滴度下調(diào)(圖5: A)，這可能是為了縮短幼蟲到成蟲所需的發(fā)育時間；而在成蟲羽化后第2天，JH滴度在低濃度人工飼料飼喂條件下反而顯著上升(圖5: A)，這可能是由于成蟲階段需要JH來促進(jìn)繁殖過程。20E滴度的變化與JH滴度的變化有所差異，無論是在若蟲還是成蟲階段20E滴度均顯著上調(diào)(圖5: B)。在幼蟲階段，20E的作用主要是促進(jìn)蛻皮(Raikheletal., 2005)，這和JH滴度在幼蟲階段下降的結(jié)果相吻合，而在成蟲階段，20E同樣具有促進(jìn)昆蟲繁殖的作用(Royetal., 2018)。由此可見，在褐飛虱發(fā)育到成蟲階段后，低營養(yǎng)濃度會通過提高JH和20E的合成進(jìn)而維持繁殖功能的正常。

綜上可知，褐飛虱在面臨營養(yǎng)缺失的情況下，營養(yǎng)信號傳導(dǎo)通路IIS, TOR以及APMK通路的關(guān)鍵基因表達(dá)均下降，而ROS水平顯著上升，通過調(diào)節(jié)AKT, FoxO以及AMPK的磷酸化水平，進(jìn)而影響JH以及20E的生物合成。