欒雨婷， 黃鐘鳴， 沈文娟， 哈明昊， 頊志兵

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院 感染性疾病科， 上海 200137

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種與胰島素抵抗(IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，包括非酒精性單純性肝脂肪變(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。隨著飲食和活動方式的改變，肥胖在全球范圍內(nèi)盛行，全球患病率約25.24%[2]，并呈上升趨勢。在大陸地區(qū)，其患病率約29.81%[3]，并已成為我國第一大慢性肝病和健康查體肝酶異常的首要原因[4]。在美國，由NAFLD所產(chǎn)生的NASH也非常普遍，預(yù)計到2030年，NAFLD、NASH及其相關(guān)HCC病例將分別增長21%、63%和137%[5]。因此，NAFLD是中國乃至世界的衛(wèi)生問題及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前其機制并未完全闡明且無特效藥物。針對NAFLD引發(fā)的肝纖維化，肝活檢是其金標(biāo)準(zhǔn)，但現(xiàn)實難以廣泛開展。然而越來越多的證據(jù)表明NAFLD是一種與代謝紊亂相關(guān)的多系統(tǒng)疾病，與2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2MD)、代謝綜合征密切相關(guān)。因此，近期國際專家小組達(dá)成共識，將其更名為代謝相關(guān)脂肪性肝病[6-8]。隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，以基因組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)為代表的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)提供了新的技術(shù)與思路。區(qū)別于其他組學(xué)技術(shù)，以內(nèi)源性小分子代謝物為研究對象的代謝組學(xué)可以很好的揭示機體變化的最終代謝結(jié)果。因此，本文就代謝組學(xué)技術(shù)在NAFLD中的研究進(jìn)展作如下總結(jié)。

1 代謝組學(xué)概述

1.1 代謝組學(xué)含義 代謝組學(xué)最初于1999年由Nicholson等[9]首先提出，是揭示機體受到外界刺激或干擾后內(nèi)源性代謝產(chǎn)物發(fā)生變化與規(guī)律的學(xué)科。根據(jù)代謝產(chǎn)物的理化性質(zhì)可以分為氨基酸類、肽類、碳水化合物類、能量類、脂類、核苷酸類、維生素和輔助因子類及外源化合物。通過高通量測序，對所測樣本進(jìn)行定性定量分析，反應(yīng)機體的代謝產(chǎn)物、途徑和規(guī)律。

1.2 代謝組學(xué)方法與過程 目前，廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集的技術(shù)平臺有氫/碳核磁共振技術(shù)(1H，13C-NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(GC-MS) 、液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜技術(shù)(CE-MS)以及直接進(jìn)樣質(zhì)譜技術(shù)(DIMS)等[10]。LC-MS因其選擇性好、高通量、靈敏度高的特點已成為代謝組學(xué)中最常用的平臺[10]。嚴(yán)格樣本采集后根據(jù)所選擇技術(shù)平臺的不同對樣本進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，然后進(jìn)行代謝物的分離分析、數(shù)據(jù)處理、生物學(xué)功能闡釋等。作為快速發(fā)展的新學(xué)科，代謝組學(xué)較為全面的展示了機體的代謝結(jié)果，為臨床醫(yī)學(xué)提供了新的技術(shù)和方法。

2 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)

NAFLD的疾病譜包括NAFL、NASH、肝硬化和HCC。盡管NAFL是一個良性的過程，可以首先通過飲食和運動來改善，但其有發(fā)展為NASH和肝硬化并引起T2MD的風(fēng)險[11]。而在其進(jìn)展過程中缺乏敏感而特定的臨床診斷生物標(biāo)志及特效藥。隨著科技的發(fā)展，代謝組學(xué)為NAFLD研究提供了強大的技術(shù)工具。

2.1 代謝組學(xué)對NAFLD發(fā)病機制研究的推動作用 NAFLD機制尚未完全明確，1998年Day等[12]提出“二次打擊”學(xué)說。隨后Tilg等[13-14]提出“多重平行打擊”理論，包括遺傳因素、IR、氧化應(yīng)激、脂毒性、慢性炎癥、纖維化、免疫和腸道菌群等，系統(tǒng)復(fù)雜涉及肝臟、腸道及脂肪組織內(nèi)的各類細(xì)胞及代謝產(chǎn)物。而高通量及高靈敏度特性的代謝組學(xué)展示了疾病狀況下的代謝產(chǎn)物及代謝網(wǎng)絡(luò)，為闡明NAFLD的發(fā)病機制帶來了新的技術(shù)手段。Cabré等[15]采用定量靶向代謝組學(xué)對因肥胖癥行減肥手術(shù)的患者(n=270)和對照組(n=50)進(jìn)行比較，以期發(fā)現(xiàn)肝臟代謝與肥胖之間的關(guān)聯(lián)性。他們發(fā)現(xiàn)NASH患者血漿中α-酮戊二酸和乳酸鹽濃度升高，表明通過谷氨酰胺分解來補充檸檬酸循環(huán)可能也是NASH發(fā)作的關(guān)鍵點。類維生素A是維持肝臟代謝穩(wěn)態(tài)的重要內(nèi)源性化合物，Zhong等[16]對正常人(n=50)肝臟和NAFLD患者(n=22)肝臟中的維生素A進(jìn)行了定量代謝組分析。與正常肝臟相比，NAFLD患者肝臟中棕櫚酸視黃酯、活性類視黃醇全反式維甲酸(all-trans-retinoic acid，atRA)、13-順式維甲酸(13-cisRA)和4-oxo-atRA的濃度顯著降低，而視黃醇水平保持不變。atRA濃度與棕櫚酸視黃酯和13-cisRA呈正相關(guān)。他們在人類組織中首次檢測到atRA的活性代謝物4-oxo-atRA，表明這種類維生素A可能有助于人體類維生素A的信號傳導(dǎo)。肝臟維生素A的穩(wěn)態(tài)平衡被打破可能導(dǎo)致疾病進(jìn)展。為了解不同類型的脂肪酸在推動NAFL向NASH早期發(fā)展中的作用，研究人員[17]利用了棕櫚酸(C16∶0)和棕櫚油酸(C16∶1)誘導(dǎo)的脂質(zhì)過載HepG2細(xì)胞模型及穩(wěn)定同位素標(biāo)記的脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行試驗。結(jié)果表明，C16∶0引起炎癥和細(xì)胞死亡，而C16∶1引起大量脂滴積聚。此外，多球殼菌素對鞘脂合成的抑制，加重了C16∶0誘導(dǎo)的脂質(zhì)凋亡。在C16∶0和C16∶1誘導(dǎo)的兩組細(xì)胞模型中脂質(zhì)譜不同，闡明了特定脂肪酸影響脂質(zhì)代謝并引起脂質(zhì)毒性或脂質(zhì)滴形成。這表明了飽和或單不飽和脂肪酸在肝脂質(zhì)毒性中起作用，同時多球殼菌素抑制作用通過神經(jīng)酰胺間接途徑加劇了脂質(zhì)凋亡。

2.2 代謝組學(xué)對NAFLD無創(chuàng)診斷的推動作用 目前用于定義NAFLD的臨床標(biāo)準(zhǔn)多樣(例如肝酶異常、肝臟超聲、肝脂肪指標(biāo)和肝活檢等)，但多數(shù)檢測和方法缺乏敏感性及特異性。超聲對輕度脂肪肝診斷的敏感性、特異性有待提高，且彌漫性肝纖維化和早期肝硬化時也可觀察到脂肪肝的典型特征[18]。盡管患者進(jìn)展至纖維化進(jìn)程較慢，但發(fā)生纖維化和肝硬化時，NAFLD患者的病死率為16%[19]。而目前“金標(biāo)準(zhǔn)”肝活檢因其有創(chuàng)且有一定并發(fā)癥，同時存在取樣及病理診斷誤差等缺陷，未能廣泛開展用于疾病的診斷及動態(tài)監(jiān)測。鑒于近期國際專家小組重新定義的NAFLD不再區(qū)分患者有無NASH，無創(chuàng)診斷NAFLD的重點需要聚焦肝纖維化、肝臟炎癥損傷及肝脂肪變程度，從而減少肝活檢的需求[20]。Moolla等[21]對3組受試者(121例NAFLD、48例酒精性肝硬化和106例對照組)進(jìn)行尿類固醇代謝組分析，發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)結(jié)果可將早期(F0～F2)與晚期(F3～F4)肝纖維化有效分離[受試者工作特征曲線下面積(AUC)=0.92]。此外，對照組分別與NAFLD晚期纖維化(AUC=0.99)和NAFLD肝硬化患者(AUC=1.0)幾乎完全分開。同時NAFLD肝硬化患者與酒精性肝硬化患者也可有效區(qū)分開(AUC=0.83)。他們認(rèn)為此方法可作為區(qū)分NAFLD纖維化程度及診斷的無創(chuàng)生物標(biāo)志物，且可以顯著減少對肝活檢的需求。Mayo等[22]對正常肝臟及NAFL和NASH的受試者血清進(jìn)行了代謝組學(xué)測定，發(fā)現(xiàn)了540種脂質(zhì)和氨基酸，通過邏輯回歸分析在467例NAFLD患者的測試組中確定了2個甘油三酸酯組的診斷模型，可分別用于區(qū)分正常肝臟和NAFL以及NASH和NAFL。該診斷模型隨后在192例(7例正常肝臟、109例NAFL和76例NASH)患者的單獨隊列中得到了驗證。Yang等[23]將受試者分為對照組(n=23)、NAFLD組(n=42)、慢性乙型肝炎(CHB)組(n=17)以及同時患有NAFLD、CHB組(n=22)共4組，進(jìn)行血清脂質(zhì)組學(xué)分析。大多數(shù)中性脂質(zhì)和神經(jīng)酰胺在同時患有NAFLD、CHB組中升高，在CHB組中降低。三?；视?triacylglycerol，TAG)在NASH患者中增加。血清單不飽和TAG是NASH的重要預(yù)測指標(biāo)，與組織學(xué)活性呈正相關(guān)(r=0.501，P<0.001)。其在NAFLD組(AUC=0.831)中顯示出對NASH的良好預(yù)測性，并在CHB組(AUC=0.833)中得到驗證；單不飽和TAG的增加可能是NAFLD和CHB患者NASH的特異性標(biāo)志物。

2.3 代謝組學(xué)對NAFLD藥物作用與療效研究的推動作用 目前針對NAFLD的藥物包括調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子類、降脂類、胰島素增敏類、平衡代謝類、抗氧化類等[24]。盡管全球發(fā)病人數(shù)眾多，但目前仍無公認(rèn)的保肝藥物用于NASH的常規(guī)治療，這可能與發(fā)病機制中信號通路相互交織靶點眾多有關(guān)。因此，藥物作用機制和療效評估顯得十分重要。國內(nèi)學(xué)者[25]采用非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法研究參苓白術(shù)散(ShenlingBaizhu San，SLBZS)對NAFLD大鼠的保護(hù)作用。結(jié)果表明SLBZS可有效減輕高脂飲食大鼠NAFLD和異常脂質(zhì)代謝。其對肝脂質(zhì)種類的影響主要與甘油磷脂和甘油脂代謝的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，通過Sirtuin 1(SIRT1)選擇性抑制劑EX527抑制肝臟中SIRT的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SLBZS對肝脂質(zhì)代謝有益作用的潛在機制可能與肝臟中的SIRT1激活有關(guān)。在一項槲皮素對NAFLD大鼠作用機制的研究中[26]，研究者通過喂食高脂蔗糖飲食30 d和50 d來建立2組NAFLD大鼠模型。結(jié)果表明，在高脂蔗糖飲食30 d模型組中，槲皮素通過調(diào)節(jié)脂肪酸相關(guān)代謝產(chǎn)物(腎上腺酸等)、炎癥相關(guān)代謝產(chǎn)物(花生四烯酸等)、氧化應(yīng)激相關(guān)代謝產(chǎn)物(2-羥基丁酸)和其他差異代謝物(檸檬酸等)來改善NAFLD。而在50 d模型組中并未改善，表明槲皮素可能通過相關(guān)代謝途徑改善早期NAFLD，但無法逆轉(zhuǎn)長期高脂飲食引起的炎癥反應(yīng)。這種將代謝組學(xué)與實驗方法相結(jié)合的方式，為研究藥物治療復(fù)雜疾病的作用和機制提供了途徑。國外研究人員[27]利用胰高血糖素樣肽1受體激動劑艾塞那肽(Exe)治療NASH模型小鼠，發(fā)現(xiàn)Exe改善了與IR和脂毒性相關(guān)的脂質(zhì)組學(xué)特性，減少了肝脂質(zhì)副產(chǎn)物(二?；视?、神經(jīng)酰胺)，降低了肝脂肪形成基因(Srebp1C，Cd36)、炎癥和纖維化相關(guān)基因(Tnfa，Timp1)的表達(dá)。此類研究可能對NASH患者中胰高血糖素樣肽1受體激動劑的潛在作用機制具有重要的臨床意義。一項基于ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸的復(fù)合維生素治療小兒NASH的研究[28]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過飲食和微量營養(yǎng)素療法治療后患者臨床及生化指標(biāo)得到改善。值得注意的是，他們首次報道了小兒NASH治療前后血漿中ω-6/ω-3脂肪酸比例變化，可用于監(jiān)測患者的預(yù)后。

3 小結(jié)

盡管代謝組學(xué)已廣泛運用于NAFLD的研究，且在各個方面均已取得一定的研究進(jìn)展。但迄今為止，僅一種生物標(biāo)志物還不能無創(chuàng)鑒別出患有NASH和輕度至中度纖維化的患者。多種脂質(zhì)及代謝物的改變參與了NAFLD的發(fā)生發(fā)展，但現(xiàn)有結(jié)果仍存在一定程度的差異，可能與研究取樣標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化[29]、儀器分析和數(shù)據(jù)處理、分析技術(shù)[30]等有關(guān)。同時，組學(xué)技術(shù)的高通量和高靈敏度對樣本的預(yù)處理[31]和數(shù)據(jù)分析方法標(biāo)準(zhǔn)化[32]也提出了更多的要求。

同時，單一的代謝組學(xué)只能從代謝角度對NAFLD進(jìn)行研究，而NAFLD是多種因素共同作用的一類疾病。盡管還未能將NAFLD的不同階段和NASH的嚴(yán)重程度準(zhǔn)確區(qū)分開，有研究者們正試圖將代謝組學(xué)與蛋白組學(xué)[33-34]、基因組學(xué)[35]等進(jìn)行多組學(xué)結(jié)合[36]研究，以期多途徑多角度確定發(fā)病的確切靶點。在未來的臨床試驗中，可能需要多指標(biāo)聯(lián)合診斷來提高檢驗效能[37]。加強多組學(xué)技術(shù)在NAFLD領(lǐng)域的臨床試驗，不僅能夠加深對NAFLD發(fā)生機制、疾病歸轉(zhuǎn)與預(yù)后的理解。同時實現(xiàn)組學(xué)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化，將NAFLD的無創(chuàng)診斷推廣至社區(qū)，構(gòu)建“家庭-社區(qū)-醫(yī)院”分層全程管理模式[38]，從而減少肝活檢需求。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：欒雨婷負(fù)責(zé)撰寫修改論文；黃鐘鳴、沈文娟、哈明昊負(fù)責(zé)參與文獻(xiàn)的收集、整理；頊志兵負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。