渠慎春,耿曉月,余心怡,曹麗芳

(南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院,江蘇 南京 210095)

miRNA(microRNA)是一類來自真核生物、長度為18～24 nt的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,由具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體剪切形成,在植物基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要功能[1-2]。1993年miRNA lin-4在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)中首次被發(fā)現(xiàn),但直到2002年第1個植物miRNA才在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[3-4]。miRNA通過與目標mRNA特異性堿基配對,對其目標mRNA切割降解或翻譯抑制,從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后的負調(diào)控功能[5]。miRNA的目標基因多為轉(zhuǎn)錄因子,主要參與植物的生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導及響應逆境脅迫等基本生物過程[6]。植物在生長發(fā)育過程中會受到多種環(huán)境脅迫的影響,大多數(shù)生物和非生物脅迫會引起氧化脅迫,損傷細胞結(jié)構(gòu)最終導致植物死亡[6]。miRNA介導植物防御的分子機制復雜而多樣,既能調(diào)控寄主目標基因的表達,也能跨界操縱病原菌基因的表達[7]。

1 植物miRNA的合成及作用機制

1.1 植物miRNA的合成

植物miRNA由內(nèi)源miRNA(MIR)基因編碼,經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、加工和RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)過程。細胞核內(nèi)MIR基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄形成具有5′端“帽子”和3′端ployA尾巴結(jié)構(gòu)的初級產(chǎn)物pri-miRNA[8]。pri-miRNA結(jié)構(gòu)中含有不完全的雙鏈發(fā)夾特殊結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)在Dicer-like 1(DCL1)酶及其輔助因子作用下被特異性識別并加工形成具有莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體pre-miRNA[9-10]。在DCL1等酶的作用下,pre-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)被加工形成具有miRNA/miRNA*復合體結(jié)構(gòu)的雙鏈miRNA[11]。miRNA/miRNA*雙鏈進一步由甲基轉(zhuǎn)移酶(Hua enhancer 1,HEN1)在3′端甲基化以防止miRNA的降解。隨后,Hasty(HST)轉(zhuǎn)運蛋白將甲基化修飾的雙鏈miRNA由細胞核轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)中。在解旋酶作用下,雙鏈miRNA解旋形成2條單鏈,其中miRNA單鏈與Argonaute 1(AGO1)蛋白結(jié)合,進一步形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)復合體,通過堿基配對與目標mRNA結(jié)合,對其目標mRNA進行切割降解或翻譯抑制[12];miRNA*鏈可能被降解,但在某些條件下,miRNA*也可能不被降解,發(fā)揮一定功能[13]。

1.2 植物miRNA的作用機制

在逆境脅迫下,植物miRNA不具有核酸酶功能,而是通過多種機制對基因進行轉(zhuǎn)錄后的表達調(diào)控[14]。miRNA對目標基因的調(diào)控方式以切割降解為主,少部分表現(xiàn)為翻譯抑制[15]。當目標mRNA與miRNA完全互補配對時,在miRNA的介導下,RISC復合體特異性識別目標mRNA[16],引導AGO1蛋白上的具有RNaseH-like內(nèi)切酶活性的PIWI結(jié)構(gòu)域?qū)⑵渲苯恿呀?從而減少目標mRNA的積累。隨后,miRNA參與的RISC復合體繼續(xù)識別并切割其他目標mRNA。與動物不同,植物miRNA對目標基因的作用位點大部分位于其CDS區(qū)。也有證據(jù)表明,一些miRNA能夠與目標mRNA的3′ 或5′ UTR區(qū)相結(jié)合來調(diào)控其表達。

當目標mRNA與miRNA之間存在一定錯配時,植物miRNA能夠抑制目標mRNA的翻譯。目標基因的表達量變化在轉(zhuǎn)錄水平上不能直接被檢測,只反映在蛋白水平上。miRNA對目標基因翻譯的調(diào)控是通過抑制mRNA翻譯起始過程實現(xiàn)的,這一過程也依賴AGO蛋白的存在。擬南芥膜整合蛋白Altered meristem programme 1(AMP1)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,與AGO1以及一種外周蛋白形成復合物后,能夠?qū)⒛繕薽RNA從膜結(jié)合多聚核糖體上解除。迄今為止,只有AGO1和AGO10被證明在翻譯抑制中發(fā)揮作用[17],在植物中并未找到更多有關miRNA參與調(diào)控目標基因蛋白合成的作用因子,miRNA介導目標mRNA翻譯抑制的具體作用機制還有待進一步挖掘。

2 果樹逆境脅迫相關的miRNA

果樹在生長發(fā)育過程中會經(jīng)歷多種環(huán)境脅迫,影響其產(chǎn)量和果實品質(zhì),造成一定的經(jīng)濟損失。研究表明,miRNA在果樹脅迫響應和抗逆性提高等方面扮演著重要的角色[18-19]。在逆境脅迫下,植物自身miRNA與AGO蛋白形成的RNA誘導沉默復合體,與目標mRNA互補配對結(jié)合,可以調(diào)節(jié)相應目標基因的表達,使下游抗逆相關基因的表達發(fā)生改變,進而影響相關代謝產(chǎn)物的生物合成,從而抵御逆境的脅迫[20]。在此過程中,一個miRNA可能調(diào)控多個目標基因[21],而一個目標基因也可受多個miRNA調(diào)控[22]。

2.1 果樹生物脅迫相關miRNA

細菌、真菌、病毒和昆蟲是影響果樹生長發(fā)育的主要生物脅迫因素,它們可導致每年約30%的果樹減產(chǎn)。果樹體內(nèi)大量miRNA會對生物脅迫做出響應,調(diào)控其目標基因的上調(diào)或下調(diào)表達[23],使果樹的生理、生化和代謝過程發(fā)生相應變化[24]。

蘋果中mdm-火疫病是由梨火疫歐式桿菌引起的一種細菌性病害。Kaja等[25]從蘋果火疫病抗病品種和感病品種中得到12個小分子RNA文庫并對其進行深度測序,發(fā)現(xiàn)mdm-miR169a、mdm-miR160e、mdm-miR167b-g和mdm-miR168a,b可能與蘋果抗火疫病抗性有關;此外,還證明蘋果中mdm-miR168a,b的目標基因是RNA誘導沉默復合體的核心組成成分AGO,其在蘋果火疫病感病品種中表達量更高;而mdm-miR167b-g隨著樹體生長在蘋果火疫病感病砧木中具有更高的表達量。mdm-miR169a、mdm-miR160e、mdm-miR167b-g和mdm-miR168a,b通過靶向應激反應蛋白參與應激反應,從而在抗火疫病中發(fā)揮重要作用[25]。蘋果莖痘病毒(ASPV)是蘋果和梨樹最常見的病毒之一。Zhang等[26]發(fā)現(xiàn)‘杜梨’和‘紅寶石’梨感染ASPV后pbr-miR156、pbr-miR164、pbr-miR399和pbr-miR482上調(diào)表達,它們的目標基因PyrusbretschneideriRibosomalproteinS6(pbRPS6)、PyrusbretschneideriNAM/ATAF/CUC(pbNAC)、PyrusbretschneideriToll-likereceptor(pbTLR)和PyrusbretschneideriRX-coiled-coil(pbRX-CC)在ASPV感染與無病毒株系中的表達沒有顯著差異,表明相應miRNA數(shù)量的增加抑制了ASPV抗性相關目標基因的表達,推測這些miRNA及其目標基因參與梨的病毒防御途徑。蟲害是影響果樹生長發(fā)育的生物脅迫之一,化學殺蟲劑的使用是控制蟲害的主要方法。昆蟲繁殖能力和適應性強、生命周期短,許多昆蟲自身對化學殺蟲劑具有抗性,這些因素導致蟲害防治工作更加困難。miRNA可調(diào)節(jié)昆蟲對化學殺蟲劑的抗性,miR-1目標靶向GlutathioneS-transferasefamilymember4(GSTm4)影響朱砂葉螨對丁氟螨酯的抗性[27],而miR-2和miR-13調(diào)控CytochromeP4509J35(CYP9J35)和CytochromeP450325BG3(CYP325BG3)的表達,介導淡色庫蚊對溴氰菊酯的抗性[28]。

真菌性病害是我國果樹生產(chǎn)中的主要病害,嚴重制約著我國果樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。Nucleotidebindingsite-leucinrichrepeats(NBS-LRR)基因是抗病基因中最大的家族。Zhu等[29]通過小RNA深度測序發(fā)現(xiàn)桃miRNA目標基因中包括多個編碼抗病蛋白的NBS-LRR基因,由此推測miRNA在桃的抗病性調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。Ma等[30]研究發(fā)現(xiàn),在40個對斑點落葉病抗性的蘋果品種中,NBS-LRR基因在抗病品種‘金冠’中的表達量明顯高于感病品種‘富士’,且與Md-miRLn11的表達呈相反趨勢,說明在病原菌侵染下,Md-miRLn11可能通過抑制目標基因Md-NBS-LRR的表達來影響不同蘋果品種對斑點落葉病的抗性。此外,Zhang等[31]利用高通量測序技術鑒定出一種novel miRNA,命名為Md-miRln20,其在蘋果感病品種中的表達量顯著高于抗病品種,而其目標基因Md-TN1-GLS則表現(xiàn)出相反的變化趨勢,表明Md-miRln20和其目標基因的表達與蘋果的炭疽葉枯病抗性密切相關,Md-miRln20通過抑制Md-TN1-GLS的表達負調(diào)控蘋果對炭疽葉枯病的抗性。白粉病侵染草莓后,miR390與目的基因TransactingsiRNA3(TAS3)間的表達模式與擬南芥類似,因此推測草莓中也存在miR390-TAS3-ARF調(diào)控模塊,miR390可能通過間接負調(diào)控Auxinresponsefactor(ARF)的表達來提高對白粉病的抗性[32]。白腐病是引起葡萄生長期果實腐爛的主要真菌病害。白腐病病原菌侵染后,刺葡萄中miR172a、miR172b、miR845a、novel_81和miR159a發(fā)生特異表達,這些miRNA的目標基因包括與抗病相關的WRKY、SQUAMOSApromoterbindingprotein-like(SPL)、EF-TUreceptor(EFR)等轉(zhuǎn)錄因子及Leucine-richrepeat(LRR)類抗病基因,可作為研究刺葡萄抗白腐病的目標[33]。香蕉受到香蕉枯萎病菌FOC4侵染后,miRNA159a、miRNA165a、miRNA399a的表達表現(xiàn)出明顯的品種特異性和組織特異性[34];Song等[35]通過對小RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn),香蕉枯萎病抗性品種與易感品種間部分miRNA表達差異十分顯著,同時發(fā)現(xiàn)miRNA靶向枯萎病菌基因組中2個重要致病基因:阿魏酸酯酶基因(Feruloylesterase,FAE)和脯氨酸亞氨基肽酶基因(Prolineiminopeptidase,PIP),這為miRNA功能研究及miRNA與病原菌互作機制研究提供了良好的思路。

本課題組通過高通量測序技術在感病品種‘富士’蘋果和抗性種質(zhì)湖北海棠中得到了24個響應蘋果輪紋病侵染的miRNA,并用熒光定量PCR手段鑒定了其中與脅迫相關的miR167、miR395、miR397和miR2111的表達模式,這些miRNA的表達在蘋果輪紋病菌侵染的不同時期呈動態(tài)變化,初步鑒定這些miRNA可能在蘋果對輪紋病防御過程中起重要作用[36]。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR397b可以調(diào)節(jié)與木質(zhì)素生物合成相關基因MalushupehensisLaccase7(MhLAC7)的表達,在湖北海棠中對蘋果輪紋病的抗性起到負調(diào)控作用[37]。

以上這些特定的miRNA途徑是否僅限于特定果樹樹種與相應病原菌的侵害,或者是所有植物與病原菌之間相互作用的通用調(diào)節(jié)機制,目前尚不清楚。值得注意的是,本課題組研究發(fā)現(xiàn),miR168和其目標基因AGO1(RISC的核心組分)的表達,在湖北海棠抵御輪紋病侵染的過程中受到精確而復雜的調(diào)控,miR168/AGO1表達穩(wěn)態(tài)的改變會引起植株多種防御途徑改變,對湖北海棠應對輪紋病的侵染起到重要作用[38]。

綜上所述,這些特定果樹miRNA參與植物防御功能機制的研究,為深入探索miRNA途徑在植物生物脅迫應答中的重要調(diào)控作用奠定了基礎。

2.2 果樹非生物脅迫相關miRNA

2.2.1 干旱干旱脅迫會對果樹的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重影響。在干旱脅迫下,果樹體內(nèi)相關miRNA會出現(xiàn)差異性表達并調(diào)控其目標基因,從而適應干旱環(huán)境。干旱脅迫可以誘導葡萄miR393在根部特異表達上調(diào),并在側(cè)根生長適應干旱脅迫的過程中發(fā)揮重要作用,在miR393啟動子區(qū)域存在特定的干旱誘導順式元件,在擬南芥中,miR393調(diào)控Transportinhibitorresponse1/AuxinSignalingF-box2(TIR1/AFB2)的表達[39],但在葡萄葉片中miR393僅負調(diào)控TIR1-like基因,說明在葡萄的根部,可能存在其他脅迫誘導調(diào)控機制干擾miRNA抑制活性[40]。香蕉馴化干旱處理和直接干旱處理試驗結(jié)果表明,馴化干旱處理后miRNA的表達量高于直接干旱處理,同時miR160a和miR164a的表達量顯著高于其他miRNA,說明這 2個 miRNA可能在香蕉抗旱過程中扮演重要角色[41-42]。西藏沙棘中2種新型miRNA(novel_miR_24和novel_miR_87)在正常生長情況下的表達水平與在干旱脅迫下的表達水平存在明顯差異,它們的靶基因參與細胞代謝和應激反應,可用于提高西藏沙棘及其他高原植物的耐旱性[43]。

2.2.2 冷害目前,果樹中已有較多的miRNA被證實在溫度脅迫中起到重要的調(diào)控作用。Liu等[44]通過高通量測序發(fā)現(xiàn)在野生香蕉中miR172、miR395和miR408對冷脅迫發(fā)生應激反應,說明這些miRNA可能在冷脅迫中發(fā)揮關鍵作用;同時,對miRNA目標位點的基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析表明,miR172可能在冷脅迫反應中發(fā)揮中心協(xié)調(diào)作用,特別是在蛋白激酶CK2(Casein kinase 2)和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中。Late embryogenesis abundant(LEA)蛋白可以在冷脅迫下保護細胞內(nèi)的蛋白和DNA并提高植物抗凍能力[45],而domain containing protein(NAC)家族轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)C-repeat binding factor(CBF)相關途徑參與耐寒性調(diào)控[46]。冷脅迫下,葡萄中miR172a表達上調(diào),miR164b和miR535a表達下調(diào),miR535a、miR172a、miR164b分別靶向LEA蛋白、Apetala 2(AP2)乙烯應答轉(zhuǎn)錄因子和NAC轉(zhuǎn)錄因子[47]。相對于桃幼葉組織,miR156、miR164、miR172、miR393、miR396、miR414和miR2275在冬芽中有特異性表達[48],表明這些miRNA可能對低溫脅迫有調(diào)控作用。

2.2.3 鹽脅迫果樹是對鹽脅迫比較敏感的植物,鹽脅迫對果樹種子萌發(fā)、生長發(fā)育和產(chǎn)量造成不同程度的影響[49]。在鹽脅迫下,柑橘根系中有76個miRNA和2 574個mRNA存在差異表達,這些基因在功能上與碳水化合物代謝、激素信號轉(zhuǎn)導、reactive oxygen species(ROS)系統(tǒng)和苯丙氨酸代謝有關,NAC、MYB domain protein(MYB)、C-repeat-binding factor(CBF)、ethylene response factors(ERF)、WRKY DNA-binding protein(WRKY)、zinc finger protein(ZFP)、calmodulin-binding protein(CAMTA)、basic-leucine zipper protein(bZIP)等轉(zhuǎn)錄因子參與鹽脅迫過程,其中大部分顯著上調(diào)表達,而少數(shù)miRNA靶向的轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達[50]。Yaish等[51]研究發(fā)現(xiàn),在鹽脅迫下棗椰樹中miRNA表達存在差異,在葉片中,54個已鑒定的miRNA受到顯著影響,其中70%的miRNA表達上調(diào);而在根中,25個已鑒定的miRNA受到顯著影響,其中76%的miRNA表達上調(diào),miRNA的靶點如鉀離子通道Arabidopsis K+transporter 2-like(AKT2-like)蛋白、液泡蛋白篩選相關蛋白、鈣依賴性蛋白等已報道與耐鹽相關。Li等[52]發(fā)現(xiàn),草莓果實受到鹽脅迫6 h后,Fan-miR73表達量明顯下降,而目標基因ABA-insensitive5(ABI5)表達量上調(diào),說明Fan-miR73在草莓鹽脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

2.2.4 營養(yǎng)元素缺失果樹在生長發(fā)育過程中各個階段對營養(yǎng)元素的需求不同,營養(yǎng)元素的缺乏也是果樹生長發(fā)育過程經(jīng)常遇到的脅迫問題。miRNA通過調(diào)控目標基因的表達來調(diào)節(jié)相關營養(yǎng)元素的代謝。研究表明草莓果實可溶性固形物含量與磷含量呈正相關,低磷脅迫誘導草莓miR399a的積累,調(diào)節(jié)植株磷平衡,以改善果實品質(zhì)[53];同時,miRNA可以通過改變根系結(jié)構(gòu),提高磷的轉(zhuǎn)運和再利用效率,參與花青素和抗氧化物生物合成等來響應低磷脅迫[54]。Liang等[55]經(jīng)Illumina測序發(fā)現(xiàn)柑橘中miR158、miR1044、miR1151、miR5261、miR6190和miR6485通過表達上調(diào)來減輕Mg脅迫。鐵脅迫誘導小金海棠miR394a在根部和葉片中表達上調(diào),但其表達模式不同;miR394a在根系中反應迅速而在葉片中反應相對較慢,缺鐵時根部首先發(fā)生缺鐵反應產(chǎn)生局部信號,信號傳至地上部,引起地上部miR394a的表達從而使地上部更耐缺鐵[56]。葡萄vvi-miR398能介導Copper/zincsuperoxidedismutase2(CSD2)基因的裂解,通過轉(zhuǎn)基因等手段對CSD2進行功能驗證,發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達葡萄CSD2能提高植株的銅脅迫抗性[57];此外vvi-miR160和vvi-miR167在銅脅迫下受到抑制,其目標基因ARF可能通過充當信號分子參與銅脅迫[58]。

3 展望

miRNA約占總基因的1%,這意味著還有許多miRNA尚未發(fā)現(xiàn)[59]。近年來,隨著對植物miRNA的深入研究,大量參與植物生物和非生物脅迫的miRNA被發(fā)現(xiàn)并鑒定出其功能。果樹在生長發(fā)育過程中會遇到很多生物和非生物脅迫,其中病原菌的脅迫可能是毀滅性的[60]。大多數(shù)果樹樹種基因組高度雜合,遺傳背景非常復雜,采用常規(guī)的基因工程育種手段,常常面臨轉(zhuǎn)化效率低且外源基因表達不穩(wěn)定的問題,難以獲得生產(chǎn)所需的穩(wěn)定一致的優(yōu)良抗性新品系。因此在生產(chǎn)中,應從miRNA入手,從抗性基因表達調(diào)控的角度,引入和發(fā)展新的基因操作手段,在果樹抗逆育種方面具有廣泛的應用前景。

目前miRNA參與植物抗逆的相關報道主要集中在擬南芥等模式植物中,而在果樹等經(jīng)濟作物中報道相對較少。隨著越來越多特定果樹miRNA的挖掘和功能的深入研究,miRNA途徑在果樹抗性調(diào)控中的重要作用將會進一步明確,這將有助于深入了解逆境脅迫下果樹防御途徑的多層次調(diào)控機制,為果樹抗性育種和品種改良提供理論依據(jù)。