梅仁 蔡夢潔 戴蘭 沈文紅 朱明清

噬血細胞綜合征（HLH）被認為是一種淋巴單核巨噬細胞系統(tǒng)反應增生的組織細胞病，主要是由于殺傷性T細胞（CTL）及NK細胞功能缺陷導致抗原清除障礙，刺激巨噬細胞活化增殖，分泌大量炎癥細胞因子而導致的一組臨床綜合征[1]。噬血細胞綜合征主要分為兩種，原發(fā)性（遺傳性）存在明確基因缺陷或家族史，為常染色體隱性遺傳或X連鎖遺傳，常見的基因有PRF1基因；繼發(fā)性可由感染（主要為EB病毒感染）、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、藥物、獲得性免疫缺陷（如移植）等多種因素引起[2]。目前診斷主要參照國際組織細胞協會2004年修訂標準[3]。HLH的診斷比較復雜，臨床表現不典型，特異性差，診斷難度大。因此，探求有效診斷方式，及時采取干預措施以減少預后風險極為重要。研究表明，HLH患者的NK細胞功能和CTL細胞功能存在缺陷[4-5]。本文旨在探索NK細胞功能和CTL細胞功能在輔助診斷繼發(fā)性噬血細胞綜合征中的作用，為臨床早發(fā)現、早診斷、早治療提供參考依據。

資料與方法

1 一般資料 選取蘇州大學附屬第一醫(yī)院2018年2月～2021年2月收治的26例繼發(fā)性HLH患者。入選標準：符合國際組織細胞協會制定的2004年診斷標準[3]。26例患者男性18例，女性8例，中位年齡45歲。同期選擇17例在我院門診接受體檢的健康者作為對照組，男性12例，女性5例，中位年齡41歲。本研究通過院倫理委員會審批。

2 試劑及儀器 儀器采用Navios流式細胞儀（Beckman coulter公司），離心機，渦旋振蕩儀等。單抗：CD3-ECD、CD56-PC7、CD8-APC（Beckman coulter公司）、CD158a-PCP5.5（Invitrogen）、CD158b-FITC（Novus Biologicals）、CD158e-PE（mitengi Biotec）、CD158i-APC（Novus Biologicals）、Perforin-FITC（BD Pharmingen）、GranzymeB-PE（BD Pharmingen），氯化銨溶血劑（QIAGEN公司），破膜劑Intracell（Dako公司）。

3 方法 以EDTA-K2抗凝管采集患者外周血2 mL，1管取100 μL外周血加入CD3，CD56，CD158a，CD158b，CD158e，CD158i抗體各5 μL混勻，室溫避光孵育15 min，溶血劑溶血，加2 mL PBS，1500 rpm離心洗滌5 min，棄上清，加500 μL PBS懸浮，上機分析。2管取100 μL外周血加CD3，CD56，CD8抗體各5 μL混勻，室溫避光孵育15 min，加固定劑A 100 μL，混勻，室溫避光固定15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min離心洗滌5 min，棄上清，震蕩懸浮細胞，加破膜劑B 100 μL，打孔5 min，加Perforin和Granzyme B抗體各2 μL，混勻，室溫避光孵育15 min，加2 mL PBS，1 500 r/min離心洗滌5 min，棄上清，加500 μL PBS懸浮，上機分析。

4 統(tǒng)計學處理 若數據為非正態(tài)分布，采用非參數Mann-Whitney秩和檢驗，以四分位數法表示。若數據為正態(tài)分布，則采用T檢驗進行分析，結果以平均值±標準差表示。運用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析和繪圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 繼發(fā)性 HLH患者淋巴細胞的比例變化 檢測繼發(fā)性HLH組和對照組淋巴細胞各組分比例，對照組淋巴細胞比例為（33.2±1.9）%，T細胞比例為65.2（54.8，71.1）%，NK細胞比例為（20.4±2.1）%，CTL細胞比例為35.2（30.2，37.9）%。而繼發(fā)性HLH組淋巴細胞比例為（18.4±2.4）%，T細胞比例為71.6（45.825，80.65）%，NK細胞比例為（7.7±1.6）%，CTL細胞比例為45.5（35.275，50.375）%。結果顯示，與對照組相比，繼發(fā)性HLH組淋巴細胞、NK細胞的比例顯著降低（P＜0.000 1，圖1A；P＜0.000 1，圖1B），CTL細胞比例顯著增高（P=0.005），且具有統(tǒng)計學差異。但是，繼發(fā)性HLH組和對照組T淋巴細胞比例無顯著差異（P=0.513）。

圖1 對照組與繼發(fā)性HLH組淋巴細胞和NK細胞比例比較

2 NK細胞KIR以及穿孔素和顆粒酶B表達情況 由于對照組和繼發(fā)性HLH組NK細胞具有顯著差異，為進一步研究NK細胞功能在繼發(fā)性HLH中的作用，我們通過流式細胞術對兩組NK細胞的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）以及穿孔素和顆粒酶B的表達水平進行檢測。流式細胞術結果顯示，繼發(fā)性HLH組KIR限制性表達率低于對照組（對照組：0/17，HLH組：7/26，P=0.031 0）。穿孔素和顆粒酶B表達情況不符合正態(tài)分布，對照組穿孔素四分位數法比例為96.6（95.1，97.8）%，繼發(fā)性HLH組穿孔素表達比例為93（67.35，97）%，P=0.016 5；繼發(fā)性HLH組NK細胞顆粒酶B四分位數法比例為85（72.125，92.75）%，略高于對照組83.8（80.6，89）%，P=0.871 7，無統(tǒng)計學意義。

3 CTL細胞穿孔素和顆粒酶B表達情況 由于對照組和繼發(fā)性HLH組CTL細胞具有明顯差異，為進一步研究CTL細胞在繼發(fā)性HLH中的作用，我們通過流式細胞術對兩組CTL細胞穿孔素和顆粒酶B的表達水平進行檢測。結果顯示，繼發(fā)性HLH組穿孔素比例為（45.34+5.38）%，略高于對照組比例（37.49+5.03）%；繼發(fā)性HLH組顆粒酶B比例為（49.31+5.97）%，略高于對照組比例為（45.18+4.67）%。兩組數據比較均無統(tǒng)計學意義（穿孔素：P=0.3207，圖2C；顆粒酶B：P=0.6219，圖2D）。

圖2 對照組與繼發(fā)性HLH組CTL細胞穿孔素與顆粒酶B表達比例比較

討 論

HLH是一種因淋巴細胞或組織細胞過度增生引發(fā)無效免疫應答，致使多個器官出現高炎癥反應的臨床綜合征，可發(fā)生于各個年齡段，病情進展迅速，預后較差。若未及時有效治療，可直接危及生命，病死率相對較高[6]。研究表明，經過不同方案治療的成人HLH患者30 d死亡率為20%～44%，總死亡率為50%～75%，腫瘤相關HLH的預后相對更差[7-8]。HLH主要特征為全血細胞減少，持續(xù)發(fā)熱，肝脾腫大，高血清鐵蛋白，高甘油三酯，低纖維蛋白原，并可在骨髓、肝、脾、淋巴結組織發(fā)現噬血現象。HLH-2004診斷標準補充說明：無論兒童或成人患者，HLH-2004診斷指南都是目前臨床診斷HLH應該遵循的原則。2018 HLH診治中國專家共識中提到運用流式細胞技術檢測NK細胞殺傷活性，到目前為止，國內外對NK細胞活性的檢測方法尚沒有統(tǒng)一規(guī)定，有待完善，而NK細胞的活性與其受體和功能有關[9-10]。本研究運用流式細胞技術檢測繼發(fā)性HLH患者NK細胞KIR受體及穿孔素和顆粒酶B表達的變化，以此判斷是否可以通過此項檢查來輔助診斷繼發(fā)性HLH。

NK細胞在機體中主要起抗腫瘤和抗病毒效應，在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[11]。NK細胞活性受其表面多種調節(jié)性受體的調控，根據功能可以分為活化性受體和抑制性受體兩大類。研究發(fā)現，KIR除了發(fā)揮抑制性受體作用阻遏殺傷功能外，還具有激活殺傷細胞的作用，其通過識別表達于靶細胞的HLA-I類分子來調節(jié)NK細胞的殺傷活性。正常情況下，活化性受體和抑制性受體表達水平處于平衡狀態(tài)，共同調節(jié)NK細胞的活性，而表達水平一旦失衡，NK細胞的殺傷活性便會減弱[12-14]。NK細胞主要通過穿孔素及顆粒酶B介導的細胞殺傷及細胞毒性發(fā)揮作用，而一旦穿孔素和顆粒酶B的分泌水平不足，機體不能有效的清除病毒，持續(xù)的抗原刺激將導致淋巴細胞和組織細胞增殖并釋放多種細胞因子（即“細胞因子風暴”），從而導致全身各個臟器功能受損，甚至死亡[15-16]。CTL細胞為CD8+T細胞活化后分化的效應細胞，其主要功能是特異性直接殺傷靶細胞，主要通過兩種機制發(fā)揮細胞毒作用，其中一種也是分泌穿孔素和顆粒酶B等物質直接殺傷靶細胞，如果分泌水平不足，機體同樣不能有效殺傷靶細胞[17]。

本研究結果顯示，繼發(fā)性HLH患者無論是淋巴細胞數量及比例，還是NK細胞數量及比例都明顯低于正常人，說明繼發(fā)性HLH患者體內NK細胞確實受到了一定程度的破壞。同時，本研究結果顯示26例繼發(fā)性HLH患者中存在7例患者NK細胞KIR受體限制性表達（僅僅表達其中一種受體），而其中4例患者都是表達抑制性受體（另外3例不在所檢測試劑內），活化性受體缺失，從而抑制了NK細胞的活化，使其殺傷作用減弱。所以繼發(fā)性HLH患者中部分患者NK細胞受體平衡狀態(tài)受到了破壞，從而減弱了NK細胞的殺傷作用。而對于NK細胞和CTL細胞穿孔素和顆粒酶B的表達，結果顯示都沒有明顯的降低，這與秦強等[18]的研究一致。另有文獻報道[19]PRF1基因突變的原發(fā)性HLH，其NK細胞與CTL細胞的穿孔素表達明顯降低，而本研究中繼發(fā)性HLH患者穿孔素的表達未見明顯變化，所以可以通過穿孔素的檢測，快速鑒別PRF1基因突變引起的原發(fā)性HLH和繼發(fā)性HLH。同時研究結果顯示，HLH患者淋巴細胞數量降低（均值0.5×109/L），低于正常人參考值下限0.8×109/L，NK細胞比例嚴重降低，CTL細胞比例明顯高于對照組，總體上NK細胞CTL細胞分泌穿孔素和顆粒酶B水平呈下降趨勢，但其表達水平與對照組差異無顯著意義，有待進一步研究其內在機制。

綜合分析，繼發(fā)性HLH患者僅僅存在淋巴細胞數量和比例的降低，而NK細胞和CTL細胞穿孔素和顆粒酶B的表達水平并沒有下降。穿孔素的檢測有可能作為臨床鑒別PRF1基因突變引起的原發(fā)性HLH和繼發(fā)性HLH的一個檢測指標。但由于例數相對較少，需要進一步擴大樣本量進行研究并加以驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突