邱立娟 付曉艷 郭凱 王孟鍵 劉禹 馬曙軒

國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，血小板同種抗體的產(chǎn)生與輸血、妊娠、器官移植及免疫系統(tǒng)疾病等有關(guān)，并且血小板抗體陽(yáng)性率隨輸血和妊娠次數(shù)增多而升高[1-3]。血小板抗體的產(chǎn)生是血小板輸注無(wú)效的主要原因之一[4-5]，進(jìn)行血小板抗體篩查與配型試驗(yàn)在提高血小板輸注效果方面具有重要意義，尤其是對(duì)于反復(fù)輸血和免疫性血小板減少的患兒。關(guān)于血小板抗體篩查和配型的研究較多，但對(duì)血小板抗體產(chǎn)生后效價(jià)的高低國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)少有報(bào)道，我們對(duì)在院60名血小板抗體強(qiáng)陽(yáng)性（4+）患兒血小板抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象：我院2019年1月～2021年3月采用固相凝集法檢測(cè)血小板抗體21 230例，對(duì)血小板抗體初篩強(qiáng)陽(yáng)性（4+）60例患兒進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，其中男性36例，女性24例，年齡1月～180月，中位年齡24（12， 93）月。

1.2 分組方法

1.2.1 年齡分組：將患兒按照月齡分為1～6月、7～12月、13～18月、19～24月、25～36月、37～120月、＞120月；

1.2.2 疾病分組：按照疾病分為血液腫瘤組、免疫疾病組、其他疾病組；

1.2.3 輸血史分組：按照有無(wú)輸血史分為有輸血史組和無(wú)輸血史組。

2 儀器與試劑

2.1 儀器：板式離心機(jī)（可成儀器有限公司）和PW-812全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（匯松儀器有限公司）。

2.2 試劑：血小板抗體檢測(cè)試劑盒（固相凝集法）（Sanquin，荷蘭）、血小板抗體篩檢細(xì)胞、血小板抗體檢測(cè)用指示紅細(xì)胞均購(gòu)自北京漢泰旭和生物科技有限公司。所有試劑均在效期內(nèi)使用。

3 檢測(cè)方法

3.1 標(biāo)本前處理：采用患兒輸血前檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行血小板抗體篩查初檢。將枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本，1 500 g離心10 min。對(duì)初檢結(jié)果強(qiáng)陽(yáng)性者（4+），將患兒血清采用試管法倍比稀釋?zhuān)捎霉滔嗄ㄑ“蹇贵w檢測(cè)試劑，人工判讀結(jié)果。

3.2 操作方法：（1）使用前將所有試劑恢復(fù)至室溫（18 ℃～25 ℃），將濃縮清洗液用純化水按1∶10體積比稀釋制備清洗液；（2）依據(jù)檢測(cè)量按需取出微孔板條，每孔（患者血清孔、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照）加入1滴（50 μL）血小板抗體篩檢細(xì)胞；（3）50 rcf離心5 min，使血小板固定到微孔板表面；（4）用清洗液洗板2次，去除未結(jié)合的血小板；（5）每孔加入2滴（100 μL）MASPATLISS，并在反應(yīng)孔中依次加入1滴（50 μL）倍比稀釋的患者血清、陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控，輕輕震蕩微孔板，使其充分混勻；（6）將微孔板在37 ℃孵育35 min（孵育過(guò)程密封微孔板）后用清洗液洗板3次；（7）每孔加1滴MASPAT抗IgG試劑及1滴MASPAT指示紅細(xì)胞，輕輕震蕩混勻，200 rcf離心5 min。

3.3 判讀結(jié)果：以可檢測(cè)到陽(yáng)性（1+）的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)為效價(jià)（下圖所示效價(jià)為64），判定方法見(jiàn)圖1。

圖1 血小板抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果

3.4 觀察指標(biāo)：（1）統(tǒng)計(jì)血小板抗體強(qiáng)陽(yáng)性（4 +）患兒血小板抗體效價(jià)分布情況。（2）患兒年齡、性別、輸血史、疾病與效價(jià)的關(guān)系。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用IBM SPSS Statistics 25.0版本軟件對(duì)4組資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，性別和輸血史與效價(jià)的關(guān)系比較采用兩個(gè)獨(dú)立標(biāo)本比較的MannWhitneyU檢驗(yàn)，年齡和疾病與效價(jià)的關(guān)系比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 60例患兒血小板抗體效價(jià)分布情況 共篩查21 230例患兒血小板抗體，檢出強(qiáng)陽(yáng)性60例（0.28%）。如圖2所示，60例血小板抗體強(qiáng)陽(yáng)性患兒血小板抗體效價(jià)結(jié)果集中在8～16。其中效價(jià)為2、4、8、16、32、64的患兒分別為5例（8.33%）、8例（13.33%）、15例（25.00%）、21例（35.00%）、9例（15.00%）、2例（3.33%）。

圖2 60例患兒血小板抗體效價(jià)分布情況

2 不同影響因素效價(jià)分布對(duì)比 如表1所示，通過(guò)對(duì)60例患兒不同性別、年齡、有無(wú)輸血史及不同疾病對(duì)患兒血小板抗體效價(jià)分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示P值均＞0.05，這表明血小板抗體效價(jià)在不同性別、年齡、有無(wú)輸血史及不同疾病上差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同影響因素對(duì)患兒血小板抗體效價(jià)分布比較

3 5例抗體陽(yáng)性患兒血小板輸注效果 檢測(cè)后進(jìn)行血小板輸注的僅有5例，其效價(jià)結(jié)果、配型情況及輸注效果詳見(jiàn)表2，5例患兒中僅進(jìn)行配型的1例（病例4）輸注有效；其余4例輸注前未進(jìn)行配型，輸注無(wú)效。

表2 5例抗體陽(yáng)性患兒血小板輸注效果

討 論

血小板表面抗原種類(lèi)較多且比較復(fù)雜，不僅包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞相關(guān)抗原，還有血小板特異抗原。反復(fù)輸血及多次妊娠者容易產(chǎn)生血小板抗體，引起免疫性血小板輸注無(wú)效[6]。血小板輸注次數(shù)越多，血小板抗體陽(yáng)性檢出率越高。按照抗原抗體再次免疫應(yīng)答機(jī)理，血小板抗篩陽(yáng)性者隨著輸血次數(shù)增加，血小板抗體效價(jià)越高，輸注效果越差。沈溪英等[7]的研究結(jié)果支持這一理論，該研究表明：血小板抗體效價(jià)＜2的患者，100%輸注有效；當(dāng)血小板抗體效價(jià)在8～32時(shí)，有77.7%患者出現(xiàn)了血小板破壞，雖輸注血小板，但循環(huán)中血小板數(shù)升高不明顯；而當(dāng)血小板抗體效價(jià)達(dá)64時(shí)，則有88.8%的患者出現(xiàn)血小板輸注無(wú)效。由此可見(jiàn)血小板抗體強(qiáng)度直接影響輸入血小板的壽命，抗體效價(jià)越高，血小板增加數(shù)越少，兩者呈負(fù)相關(guān)。此外，有研究表明[8]血小板抗體強(qiáng)度越高，相應(yīng)的配型相合率就越低，對(duì)于抗體強(qiáng)度4+的患者，因患者體內(nèi)存在大量的血小板抗體，若首次配型不相合，通過(guò)再次配型找到相合的血小板概率很低。因此，血小板抗體效價(jià)檢測(cè)可能對(duì)預(yù)測(cè)配型結(jié)果有一定幫助。

本研究結(jié)果顯示，血小板抗體效價(jià)2～4的患者13例，8～16的患者36例，32的患者9例，＞64的患者2例，血小板抗體效價(jià)主要集中在8～16。這些結(jié)果與沈溪英等[7]的28例血小板抗體效價(jià)分布情況不一致，該結(jié)果顯示效價(jià)主要集中在8～64，且＞64者占比達(dá)50%。分析不一致的主要原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）沈溪英等[7]的研究對(duì)象為成人，且是多次輸注濃縮血小板的患者，本研究以?xún)和癁檠芯繉?duì)象，有輸血史者僅15例，且輸血次數(shù)多未超過(guò)3次。（2）檢測(cè)方法不同，她采用雙抗體夾心固相酶免疫法，本研究采用固相凝集法，由于檢驗(yàn)方法有一定的局限性，受特異性抗原、紅細(xì)胞指示液濃度等影響較大[9]，操作者倍比稀釋手法以及固相凝集法檢測(cè)血小板抗體效價(jià)的操作方法，都會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。（3）另外，1997年時(shí)輸注的都是手工分濃縮血小板，里面白細(xì)胞含量比機(jī)采板高，更容易產(chǎn)生血小板抗體[10]。多項(xiàng)研究證實(shí)[11-13]，引起血小板輸注無(wú)效的免疫因素以同種抗體為主，其中大部分（約80%～90%）是由白細(xì)胞抗原引起，僅約10 %～20 %由血小板特異性抗原引起。

楊乾坤等[8]通過(guò)分析多次輸血患者的血小板抗體陽(yáng)性率和抗體強(qiáng)度之間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血小板抗體的產(chǎn)生與輸血次數(shù)呈正相關(guān)，且輸血次數(shù)越多抗體強(qiáng)度越高。但是，本研究結(jié)果顯示，血小板抗篩陽(yáng)性患兒的抗體效價(jià)分布與有無(wú)輸血史之間并無(wú)差異（P＞0.05），可能與本研究有輸血史的患者很少，且不一定是輸注血小板，輸注次數(shù)多數(shù)也不超過(guò)3次有關(guān)。反復(fù)輸注紅細(xì)胞/血小板是血液病、實(shí)體腫瘤和免疫性血小板減少患兒支持治療的重要手段，因懸浮紅細(xì)胞和機(jī)采血小板中均含有一定數(shù)量的白細(xì)胞，隨輸血次數(shù)增加， 血小板抗體陽(yáng)性率也就增大[14-15]。陸樂(lè)等[16]研究顯示，血小板抗體陽(yáng)性率在不同的臨床科室分布有顯著差異，風(fēng)濕免疫科、血液內(nèi)科和中醫(yī)科血小板抗體陽(yáng)性率明顯高于其他臨床科室，這與臨床科室患者疾病有關(guān)。但本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)血小板抗篩陽(yáng)性患兒的抗體效價(jià)分布在不同疾病組之間存在差異（P＞0.05）。所以盡管疾病、輸血史會(huì)導(dǎo)致血小板陽(yáng)性率增加，但對(duì)于血小板效價(jià)的影響卻不明顯。此外，本研究結(jié)果顯示效價(jià)分布在不同性別和年齡間無(wú)差異（P＞0.05），但袁慧銘[3]研究顯示，血小板抗體陽(yáng)性率女性高于男性，這可能與女性的妊娠有關(guān)，而本研究對(duì)象為兒童，無(wú)妊娠史。

為明確不同效價(jià)抗體陽(yáng)性患者血小板輸注效果，我們對(duì)檢測(cè)后輸注血小板的5例病例分析。結(jié)果顯示，5例患兒中僅進(jìn)行配型的病例4輸注有效，其余病例，盡管血小板抗體效價(jià)高，但受限于當(dāng)天血小板資源緊缺或患兒病情緊急，輸注之前未進(jìn)行配型，結(jié)果顯示輸注后24 h CCI均≤4.5，表明輸注無(wú)效。楊乾坤等[8]研究結(jié)果表明，如果血小板抗體陽(yáng)性患者不進(jìn)行血小板交叉配型，而是隨機(jī)輸注血小板，有近七成的患者可能會(huì)出現(xiàn)輸注無(wú)效或是效果不理想的情況。目前，血小板輸注已成為有效預(yù)防或改善患者出血的重要手段，由此可見(jiàn)，對(duì)于血小板抗體強(qiáng)陽(yáng)性患者建議臨床在輸注血小板之前進(jìn)行配型，可以從血源降低血小板輸注無(wú)效風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于血小板抗體效價(jià)高的患兒尤為注意，一般情況下效價(jià)越高則輸注效果越差。這樣不僅提高了患兒血小板輸注有效率，而且節(jié)約了血液資源，促進(jìn)了臨床輸注血小板工作安全合理有效的開(kāi)展。

綜上所述，血小板強(qiáng)陽(yáng)性（4+）患兒抗體效價(jià)分布不一，并且效價(jià)強(qiáng)度與輸血次數(shù)和疾病之間的關(guān)系尚有爭(zhēng)議，本研究也有研究病例數(shù)偏少的局限性。但血小板抗體效價(jià)對(duì)于預(yù)測(cè)血小板配型結(jié)果，提高血小板輸注的有效率有一定的幫助。由于檢測(cè)后進(jìn)行血小板輸注的僅有5例，本研究未能對(duì)不同抗體效價(jià)患兒輸注效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有待進(jìn)一步積累病例資料進(jìn)行后續(xù)研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突