楊 龍，劉春明，王正飛，崔 聰

(1.鄭州市第七人民醫(yī)院心血管外科，河南 鄭州 450000；2.河南省胸科醫(yī)院心血管外科，河南 鄭州 450000)

心血管疾病在人群中的發(fā)病率和病死率始終位居所有疾病的前3位，是危害全球人類健康的重要疾病[1-2]。目前，藥物溶栓及介入治療等措施使冠狀動脈血流再恢復(fù)灌注是較為有效的治療手段。然而，再灌注可能存在溶栓后心律失常和局部出血等心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)。MIRI常伴隨細(xì)胞氧化應(yīng)激過程，使心肌血管微環(huán)境中多種有害產(chǎn)物堆積，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死。

銀杏葉提取物(ginkgo biloba extract，GBE)的主要成分黃酮及銀杏內(nèi)酯，具有清除氧自由基、促進血管平滑肌舒張作用，對心肌梗死具有重要的防治作用[3-4]。微RNA(microRNA，miRNA)在生物體內(nèi)可與相應(yīng)靶基因的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合，進而引起靶基因的降解或抑制其翻譯蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。研究表明，miRNAs可通過靶向細(xì)胞存活或凋亡通路中的關(guān)鍵分子，如B淋巴細(xì)胞瘤-2凋亡調(diào)控因子、熱休克蛋白70、磷脂酰肌醇3激酶和去乙?；?等基因影響心肌細(xì)胞的生物學(xué)功能[5-6]，導(dǎo)致這些基因在MIRI患者的血清及心肌組織中特異性表達(dá)[7]，因此，miRNAs可能成為MIRI的早期防治重要生物標(biāo)志物。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠MIRI模型，觀察GBE對MIRI大鼠心肌組織中miRNA表達(dá)的影響，以期探討GBE在MIRI發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物無特定病原體級8周齡雄性Sprague Dawley大鼠48只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，出售許可證號：SCXK(京)2019-0006，動物質(zhì)量合格證編號：1100111911006370，體質(zhì)量250～300 g，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)于通風(fēng)良好、溫度和濕度適宜的實驗室，12 h/12 h光照晝夜節(jié)律。本研究中的所有實驗動物操作符合實驗動物倫理學(xué)委員會的動物實驗標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑40 g·L-1多聚甲醛購自上海尚炫生物公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，GBE(貨號：CP2015)購自紹興東靈保健食品有限公司，F(xiàn)ast7500實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀購自美國ABI公司，miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；BL-420S型生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司，石蠟切片機購自北京六一儀器公司，紫外可見分光光度計購自西安禾普生物科技有限公司，全自動生物化學(xué)分析儀購自深圳邁瑞生物電子有限公司，光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組和模型構(gòu)建48只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后按隨機區(qū)組設(shè)計原則分為假手術(shù)組、MIRI組、低劑量GBE(low-dose GBE，L-GBE)組和高劑量GBE(high-dose GBE，H-GBE)組，每組12只。假手術(shù)組和MIRI組大鼠給予2 mL生理鹽水灌胃，L-GBE組和H-GBE組大鼠分別給予50、100 mg·kg-1的GBE溶液灌胃，每次給藥前12 h對大鼠進行禁食不禁水處理，連續(xù)給藥7 d，最后一次給藥為造模前2 h。MIRI組、L-GBE組和H-GBE組大鼠參照文獻(xiàn)[8]采用栓線法制備大鼠MIRI模型：于大鼠胸骨左緣3～4肋間切開胸壁暴露出心臟，將左冠狀動脈前降支進行結(jié)扎，結(jié)扎線由直徑2 mm的PE管中穿出。PE管的一端用來阻斷冠狀動脈血流，另一端采用動脈夾進行固定；以心電圖ST段開始呈弓背向上為缺血梗死標(biāo)志，肉眼可見血管支配區(qū)心室肌顏色由蒼白變成紫紺色，持續(xù) 30 min 后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流再灌注120 min。假手術(shù)組大鼠僅開胸、暴露心臟，不予冠狀動脈結(jié)扎。造模過程中MIRI組、L-GBE組、H-GBE組大鼠分別死亡3、2、1只。

1.3.2 大鼠心臟功能檢測應(yīng)用生物機能實驗系統(tǒng)檢測4組大鼠心肌缺血發(fā)生前10 min(T0)、缺血后30 min(T1)、缺血再灌注30 min(T2)、缺血再灌注60 min(T3)、缺血再灌注120 min(T4)的心率，并記錄T4時J點抬高值。

1.3.3 大鼠心臟組織取材和HE染色正常組大鼠麻醉后采集心臟組織標(biāo)本，MIRI組、L-GBE組和H-GBE組根據(jù)實驗需求取大鼠心肌梗死組織約1 cm×1 cm×1 cm，置于40 g·L-1多聚甲醛中固定，用流水沖洗1 h，脫水、透明、浸蠟和包埋后，連續(xù)切片并固定；經(jīng)體積分?jǐn)?shù)100%、95%、90%、85%和80%梯度乙醇及二甲苯浸泡脫蠟后置于蘇木精染液中，伊紅染液染色后，脫水透明并封片，在光學(xué)顯微鏡下(×200)觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。其余心臟組織放入液氮中迅速冷凍用于后續(xù)基因測序和qRT-PCR檢測。

1.3.4 MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織中miRNA測序分別取MIRI組和H-GBE組3只大鼠心肌梗死組織進行miRNA測序。測序平臺為Illumina Hiseq 2500，利用R語言edgeR包將各組數(shù)據(jù)分別計算出各個樣本基因的表達(dá)量、均值和基因變化倍數(shù)(foldchange)，轉(zhuǎn)換為log2(foldchange)后，以P<0.05且log2(foldchange) 的絕對值>1.2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)基因。

1.3.5 qRT-PCR法檢測MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織中差異表達(dá)miRNA的相對表達(dá)量將MIRI組和H-GBE組大鼠心肌梗死組織加入TRIzol并進行研磨，隨后加入200 μL氯仿，反復(fù)劇烈搖晃后，室溫放置5 min。4 ℃下12 000×g離心15 min，吸取三層勻漿最上層約400 μL無色上清，置于另一無酶離心管內(nèi)；加500 μL異丙醇，混勻上下?lián)u晃，在室溫放置10 min，4 ℃ 下12 000×g離心10 min，將上清棄掉。加體積分?jǐn)?shù)75%乙醇1 mL，上下顛倒后在4 ℃下 7 500×g離心5 min，將上清棄掉。在濾紙上將開口的離心管倒置10 min后，加20 μL的無酶水促使離心管內(nèi)沉淀溶解；吸取1.0 μL溶解液，在核酸蛋白分析儀上測定RNA濃度。根據(jù)A260/A280值，確定是否存在DNA或者蛋白污染。經(jīng)miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行加尾后，使用miRcute 增強型 miRNA 熒光定量檢測試劑盒在Fast7500 qRT-PCR儀進行檢測，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miRNAs的相對表達(dá)量。 實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測和信號通路富集分析使用miRwalk數(shù)據(jù)庫(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)對特異性miRNAs進行靶基因預(yù)測和功能注釋，通過基因本體(gene ontology,GO)和京都基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)對上述獲得的差異表達(dá)基因進行生物學(xué)過程、細(xì)胞組分、分子功能和相關(guān)信號通路預(yù)測，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，容錯率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<5%。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心率和J點抬高值比較結(jié)果見表1。4組大鼠T0時心率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.659，P>0.05)。MIRI組、L-GBE組和H-GBE組大鼠T1、T2、T3、T4時心率顯著低于假手術(shù)組，J點抬高值顯著大于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；L-GBE組和H-GBE組大鼠T1、T2、T3和T4時心率顯著高于MIRI組，J點抬高值顯著小于MIRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；H-GBE組大鼠T1、T2、T3和T4時心率顯著高于L-GBE組，J點抬高值顯著小于L-GBE組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠心率及J點抬高值比較Tab.1 Comparison of heart rate and J-point elevation value of rats among the four groups

2.2 4組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化結(jié)果見圖1。假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間質(zhì)未見明顯炎癥浸潤和水腫，心肌細(xì)胞未發(fā)生顯著的變性和壞死。MIRI組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)明顯的空泡樣變性壞死，炎癥浸潤程度明顯增加。與MIRI組相比，H-GBE組和L-GBE組大鼠心肌組織紊亂程度降低，炎癥浸潤減少，水腫程度降低，H-GBE組大鼠心肌組織損傷程度較L-GBE組更低。

A：假手術(shù)組；B：MIRI組；C：L-GBE組；D：H-GBE組。圖1 4組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)(HE染色，×200)Fig.1 Pathomorphology of myocardium of rats in the four groups (HE staining,×200)

2.3 MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織中差異表達(dá)miRNAs篩選結(jié)果結(jié)果見圖2。MIRI組和H-GBE組大鼠心肌梗死組織共鑒定出1 290個miRNAs，其中miR-144、miR-200b、miR-34、miR-146、miR-21、miR-155和miR-200c呈差異表達(dá)。H-GBE組大鼠心肌組織中miR-144、miR-200b顯著高于MIRI組，miR-21、miR-34、miR-146、miR-155和miR-200c顯著低于MIRI組(P<0.05)。

圖2 MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織miRNAs差異表達(dá)熱圖Fig.2 Heatmap of differentially expressed miRNAs in myocardium of rats between the MIRI group and H-GBE group

2.4 MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織差異表達(dá)miRNAs相對表達(dá)量比較結(jié)果見表2。H-GBE組大鼠心肌組織中miR-144、miR-200b相對表達(dá)量顯著高于MIRI組，miR-34、miR-155、miR-21、miR-146和miR-200c相對表達(dá)量顯著低于MIRI組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 MIRI組和H-GBE組大鼠心肌組織miRNAs相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of relative expression of miRNAs in myocardium of rats between the MIRI group and H-GBE group

2.5 差異表達(dá)miRNAs靶基因預(yù)測和信號通路富集分析結(jié)果見圖3。使用miRwalk數(shù)據(jù)庫對上述7個差異表達(dá)miRNAs進行靶基因預(yù)測，共富集到3 401個靶基因；對靶基因進行KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，7個差異表達(dá)miRNAs主要參與叉頭框O(forkhead Box O，F(xiàn)oxO)信號通路、自噬、Hippo信號通路、軸突導(dǎo)向、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信號通路和生物學(xué)過程。

圖3 差異表達(dá)miRNAs的KEGG信號通路Fig.3 KEGG signaling pathway of differentially expressed miRNAs

3 討論

全球每年因心血管疾病死亡患者約占全球總死亡人數(shù)的1/3，而心肌梗死由于其病情進展迅速，成為心血管疾病防治的重點和難點。目前研究普遍認(rèn)為，MIRI過程是由多種類型的分子、不同的細(xì)胞、多個組織共同參與的一個復(fù)雜調(diào)控過程[9-10]。隨著對心肌缺血再灌注研究的不斷深入，目前已基本清楚該過程的發(fā)生與炎癥浸潤、氧化應(yīng)激損傷、血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧壞死和細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)[11-12]。但尚缺乏參與調(diào)控上述生物學(xué)過程全面且高效的藥物。近年來，GBE被發(fā)現(xiàn)在防治心腦血管疾病中具有較高的藥用價值。GBE主要藥用成分為總黃酮及銀杏內(nèi)酯，其中總黃酮在抗氧化、清除自由基和調(diào)控免疫應(yīng)答等過程具有重要作用，而銀杏內(nèi)酯則可通過活血化瘀改善心血管疾病[13-14]。本研究結(jié)果顯示，MIRI組、L-GBE 組和H-GBE組大鼠T1、T2、T3、T4時心率顯著低于假手術(shù)組，J點抬高值顯著大于假手術(shù)組； L-GBE 組和H-GBE組大鼠T1、T2、T3和T4時心率顯著高于MIRI組，J點抬高值顯著小于MIRI組；H-GBE 組大鼠T1、T2、T3和T4時HR 顯著高于L-GBE組，J點抬高值顯著小于L-GBE組。假手術(shù)組大鼠心肌結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間質(zhì)未見明顯炎癥浸潤和水腫，心肌細(xì)胞未發(fā)生顯著的變性和壞死。MIRI組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)明顯的空泡樣變性壞死，炎癥浸潤程度明顯增加。與MIRI組相比，H-GBE組和L-GBE組大鼠心肌組織紊亂程度降低，炎癥浸潤減少，水腫程度降低，H-GBE組大鼠心肌組織損傷程度較L-GBE組更低。這一結(jié)果說明，MIRI導(dǎo)致了大鼠心功能損傷，GBE可逆轉(zhuǎn)MIRI導(dǎo)致的大鼠心功能損傷，高劑量GBE(100 mg·kg-1)作用更為顯著，較為適合GBE對MIRI大鼠模型的藥物功能學(xué)研究。

miRNA廣泛參與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。近期大量研究集中關(guān)注GBE緩解缺血再灌注過程[15-16]，但研究該過程參與的關(guān)鍵miRNA較少，且缺少GBE干預(yù)后心肌組織miRNA變化的全譜性研究。本研究基因測序結(jié)果顯示，MIRI組和H-GBE組大鼠心肌梗死組織共有1 290個miRNAs表達(dá)，其中miR-144、miR-200b、miR-34、miR-155、miR-21、miR-146和miR-200c呈差異表達(dá)；利用miRwalk數(shù)據(jù)庫對上述7個差異表達(dá)miRNA進行靶基因預(yù)測，共富集到 3 401個靶基因，對靶基因進行KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，7個差異表達(dá)miRNA主要參與FoxO信號通路、自噬、Hippo信號通路、軸突導(dǎo)向、TNF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、mTOR信號通路和生物學(xué)過程。本研究qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，H-GBE組大鼠心肌組織中miR-144相對表達(dá)量顯著高于MIRI組，說明GBE可能通過增加miR-144的表達(dá)對MIRI導(dǎo)致的心功能損傷起保護作用。MiR-200是一個多功能miRNA家族，由miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429組成[15]，但其在MIRI中的相關(guān)作用尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b和miR-200c在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的水平受活性氧介導(dǎo)[16]；本研究結(jié)果顯示，H-GBE組大鼠心肌組織miR-200b相對表達(dá)量顯著高于MIRI組，miR-200c相對表達(dá)量顯著低于MIRI組，提示心肌在缺血再灌注過程中產(chǎn)生的活性氧可能會影響miR-200b和miR-200c的表達(dá)，而GBE可能通過提高miR-200b或降低miR-200c的水平抑制MIRI造成的心肌損傷。MiR-21和miR-146可通過靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B，激活caspase-3和caspase-8而抑制MIRI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用[17-18]。本研究結(jié)果顯示，H-GBE組大鼠心肌組織中miR-21和miR-146 相對表達(dá)量顯著低于MIRI組，提示GBE可能通過抑制大鼠心肌組織中miR-21和miR-146表達(dá)水平促進損傷的心肌細(xì)胞凋亡，進而增強心肌組織自我修復(fù)，保護心肌組織。miR-34被發(fā)現(xiàn)在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中高表達(dá)，通過靶向沉默調(diào)節(jié)蛋白保護MIRI所致的心肌細(xì)胞凋亡[19]。MiR-155在MIRI發(fā)生、發(fā)展過程中可通過促進心肌梗死組織浸潤的白細(xì)胞釋放，在缺血誘導(dǎo)的心肌缺氧條件下可增加活性氧的產(chǎn)生[20-21]。本研究結(jié)果顯示，H-GBE組大鼠心肌組織中miR-34和miR-155相對表達(dá)量顯著低于MIRI組，說明GBE可能通過調(diào)控miR-34和miR-155控制心肌梗死組織的活性氧水平，進而影響受損的心肌細(xì)胞凋亡過程，從而對心功能發(fā)揮保護作用。

綜上所述，miRNAs在MIRI發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，而GBE可通過影響心肌組織miRNA的表達(dá)水平對MIRI起保護作用。本研究只在miRNA水平進行了GBE對大鼠心肌MIRI組織的相關(guān)探索，尚缺乏進一步的機制研究。隨后的研究可從這些關(guān)鍵miRNA入手，探索GBE保護MIRI的相關(guān)機制可能具有重要意義。