王曉蕾，郭佳慶，常海寬，高寧寧，張 杰，李曉芳，馬聞苛，楊明月，徐璐丹，張紅偉，樊 騰，岳修勤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 衛(wèi)輝 453100)

介入治療(血管內(nèi)球囊擴張成形術(shù)和支架植入術(shù))和外科冠狀動脈旁路移植術(shù)是及時恢復(fù)冠狀動脈阻塞引起的急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者血流、緩解心絞痛、提高生活質(zhì)量和降低冠狀動脈性心臟病死亡風(fēng)險的有效方法，但心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI) 是其常見并發(fā)癥[1-2]。隨著冠狀動脈旁路移植術(shù)的廣泛開展，心臟手術(shù)過程中不可避免地發(fā)生IRI。有研究表明，包括七氟烷在內(nèi)的吸入麻醉藥可以緩解心肌IRI[3]。本研究旨在探討七氟烷后處理對大鼠心肌IRI的影響，以期為臨床心臟手術(shù)中IRI的心肌保護及器官移植中的供體保護提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康成年雄性Sprague Dawley大鼠30只，日齡60～80 d，體質(zhì)量250～300 g，由山東省實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器水合氯醛購自青島宇龍海藻公司，七氟烷購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司，肝素鈉注射液購自江蘇萬邦生化醫(yī)療股份有限公司，大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；七氟烷揮發(fā)罐購自北京佰泰柯醫(yī)療科技有限公司，RGZ-120型體重計購自河南曙光健士醫(yī)療器械集團股份有限公司，ALC-V8動物呼吸機和多功能生物信號采集系統(tǒng)購自上海奧爾特生物科技有限公司，普通高速離心機(Scientific PICO17)和全波長掃描酶標儀購自美國Thermo Scientific公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(B20)購自德國Heraeus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組及干預(yù)措施將30只大鼠按照隨機數(shù)字表法分為對照組、缺血再灌注組和七氟烷組，每組10只。3組大鼠的體質(zhì)量和平均日齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，12 h 明暗交替，溫度20～25 ℃，自由進食水。實驗前12 h禁食，但可自由飲水。缺血再灌注組和七氟烷組大鼠制備IRI 模型[4-6]，具體造模方法為：使用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(300 mg·kg-1)。將大鼠四肢、頭部仰臥固定于手術(shù)臺，頸、胸部剃毛，碘伏消毒、鋪巾，行正中氣管(第3氣管軟骨環(huán))切開術(shù)并行氣管插管，連接ALC-V8型動物呼吸機進行人工通氣。以針狀電極監(jiān)測大鼠心電圖。依次分離大鼠皮下組織、胸前肌肉及筋膜，暴露左冠狀動脈，在左心耳下方2 mm處用眼科針3-0絲線穿線，進針深度為1.0～1.5 mm，寬度為2.0～3.0 mm，結(jié)扎冠狀動脈左前降支。結(jié)扎過程要在1～2 min完成，如呼吸不好，胸外人工按摩幾次，待自主呼吸穩(wěn)定后再進行后續(xù)實驗。冠狀動脈結(jié)扎后大鼠心肌缺血，隨著缺血時間延長，缺血心肌顏色變白，心電圖表現(xiàn)為 ST 段抬高和(或)T弓背向上抬高即表明造模成功。缺血再灌注組大鼠冠狀動脈結(jié)扎30 min后,拔出栓線再灌注120 min；七氟烷組大鼠于再灌注前1 min吸入體積分數(shù)2%七氟烷15 min，其余步驟同缺血再灌注組；對照組大鼠手術(shù)步驟同缺血再灌注組，但不結(jié)扎冠狀動脈。缺血再灌注組和七氟烷組大鼠在缺血處理中各死亡1只。整個實驗過程均嚴格按照動物倫理要求。

1.3.2 3組大鼠心率(heart rate，HR)和平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)監(jiān)測麻醉大鼠后，在大鼠四肢安裝心電圖導(dǎo)聯(lián)，連接多功能生物信號采集系統(tǒng),右頸動脈置管，全程監(jiān)測并記錄大鼠開胸前(T0)、缺血10 min(T1)、缺血30 min(T2)、再灌注30 min(T3)、再灌注60 min(T4)、再灌注120 min(T5)時的HR和MAP。

1.3.3 ELISA法檢測3組大鼠血清中cTnI、 CK-MB、 LDH水平缺血再灌注120 min后，于大鼠右頸動脈取血8 mL，肝素抗凝，靜置15～20 min，3 000 r·min-1離心10 min，收集血清，于-20 ℃冰箱過夜后置于-70 ℃冰箱保存待用。采用ELISA法檢測各組大鼠血清中cTnI、CK-MB、LDH水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值，建立標準曲線，并計算cTnI、CK-MB、LDH水平。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠各時間點HR和MAP比較結(jié)果見表1。T3、T4、T5時缺血再灌注組和七氟烷組大鼠的HR和MAP顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T3、T4、T5時七氟烷組大鼠的MAP顯著高于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T0、T1、T2時3組大鼠的HR和MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。T3、T4、T5時缺血再灌注組與七氟烷組大鼠的HR比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組大鼠各時間點HR和MAP比較Tab.1 Comparison of HR and MAP of rats among the three groups at different time points

對照組大鼠T1、T2、T4時的HR顯著低于T0時，T3、T5時的HR顯著高于T0時，T2、T3、T4、T5時的MAP顯著低于T0時，T2時的HR顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR顯著高于T1時，T2、T3、T4、T5時的MAP顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR顯著高于T2時，T3、T5時的MAP顯著低于T2時，T4時的MAP顯著高于T2時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對照組大鼠T0與T1時的MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，T3、T4、T5時的HR、MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

缺血再灌注組大鼠T2、 T3、T4、T5時的HR和MAP顯著低于T0、T1時，T3、T4、T5時的HR和MAP顯著低于T2時，T4、T5時的HR顯著低于T3時，T5時的MAP顯著低于T3時，T5時的HR和MAP顯著低于T4時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。缺血再灌注組大鼠T0與T1時的HR、MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，T3與T4的MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

七氟烷組大鼠T1、T2、 T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T0時，T2、 T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T2時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。七氟烷組大鼠T3、T4、T5時的HR、MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較結(jié)果見表2。缺血再灌注組和七氟烷組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。七氟烷組大鼠血清中cTn-I、LDH、CK-MB水平均顯著低于缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較Tab.2 Comparison of the levels of serum cTnI，LDH and CK-MB of rats among the three groups

3 討論

冠狀動脈閉塞之后，及時恢復(fù)缺血心肌的血流可以迅速限制梗死面積，改善心肌功能，降低急性死亡率，但廣泛使用再灌注策略和輔助藥物治療，可導(dǎo)致慢性心力衰竭及缺血再灌注綜合征的發(fā)病率增加[7-8]。MURRY等[9]首次提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)的概念，即短暫的心肌缺血能使心臟耐受更長時間的缺血刺激。但實驗研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，在心肌血流受阻之前，IPC對IRI的心肌有保護作用[10]，因此其臨床應(yīng)用比較局限。七氟烷預(yù)處理對心肌的保護作用已得到證實，其具體機制也有報道[11-16]。大量研究發(fā)現(xiàn)，七氟烷預(yù)處理具有和IPC相似的心肌保護作用，但同樣受治療時機的臨床限制[17-18]。藥物后處理即通過調(diào)節(jié)再灌注，包括在再灌注開始時立即引入缺血刺激或揮發(fā)性麻醉劑來保護器官可減輕IRI。藥物后處理與預(yù)處理對IRI的保護機制理論上相似，預(yù)處理和后處理關(guān)鍵的生物化學(xué)因素均為保護線粒體和減少炎癥介質(zhì)釋放。使用藥物后處理，相較于缺血預(yù)處理可減少有創(chuàng)操作，相較于藥物預(yù)處理可緩解治療時機局限性。

吸入麻醉藥具有高親脂性，無特異受體介導(dǎo)，容易跨細胞膜擴散，與細胞膜或細胞質(zhì)內(nèi)受體結(jié)合形成復(fù)合物等優(yōu)點，因此吸入麻醉藥在保護缺血的心肌方面更具優(yōu)勢。七氟烷作為臨床上常用的吸入麻醉藥，誘導(dǎo)起效快，可控性強，停止吸入后基本上通過呼吸迅速排泄，停止吸入后肺泡內(nèi)濃度迅速降低，對呼吸和循環(huán)影響小[19]。

缺血再灌注可通過細胞內(nèi)鈣超載、細胞線粒體能量代謝障礙以及氧自由基損傷等機制，造成心肌細胞損傷或壞死，繼而引發(fā)細胞膜通透性改變，導(dǎo)致心肌細胞胞質(zhì)物質(zhì)(心肌酶和心肌蛋白)釋放入血。心肌酶是臨床檢測心肌細胞損害程度的重要指標。有研究發(fā)現(xiàn)，CK-MB廣泛存在于心肌細胞中,是臨床診斷心肌損傷的有效指標，當冠狀動脈性心臟病患者發(fā)生典型胸痛時，CK-MB水平將在3～8 h升髙，16～24 h達到髙峰，3 d后逐漸恢復(fù)正常，對預(yù)測冠狀動脈病變程度具有良好效果;LDH廣泛存在于人體各個組織中，多見于心肌細胞中，冠狀動脈性心臟病患者發(fā)生急性心肌梗死后12～24 h LDH水平逐漸升高，48～72 h達到高峰，10～12 d恢復(fù)正常，同時隨著冠狀動脈病變支數(shù)的增加，LDH水平逐漸增高，臨床多將LDH應(yīng)用于心肌梗死的診斷中[20]。cTnⅠ是反映心肌細胞急性損傷的指標，具有較高特異性，于冠狀動脈性心臟病患者典型胸痛發(fā)生后1～6 h開始升髙，診斷窗口期為4～8 h[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在短時間內(nèi)的心肌缺血刺激下，心臟可大量釋放cTnI，通過對cTnI水平的檢測可有效判斷心肌受損面積，且可作為微小心肌損傷的早期標志[22]。 cTnI和CK-MB是心肌損傷時最敏感的特異性指標，其數(shù)值大小與心肌損傷程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組和七氟烷組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組，七氟烷組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著低于缺血再灌注組，提示七氟烷后處理可以減少血流再灌注后心肌損傷，降低心肌損傷標志物cTnI、LDH和CK-MB水平，間接表明七氟烷后處理可以減少IRI引起的心肌損傷。

本研究選擇雄性大鼠為研究對象，排除了性別差異(雌激素)對實驗的影響。本研究采用經(jīng)典的結(jié)扎左冠狀動脈前降支的方法制作IRI模型，易于操作，可行性強。本研究通過監(jiān)測大鼠不同時間點血流動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，T0、T1、T2時3組大鼠的HR和MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于缺血再灌注前機體應(yīng)激反應(yīng)及自身調(diào)節(jié)，使缺血再灌注組、七氟烷組大鼠血流動力學(xué)與對照組比較無明顯變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T3、T4、T5時缺血再灌注組和七氟烷組大鼠的HR和MAP顯著低于對照組，提示再灌注后可能由于氧自由基的增多、鈣離子超載、炎癥因子釋放等因素導(dǎo)致心肌損傷加重；且T3、T4、T5時七氟烷組大鼠的MAP顯著高于缺血再灌注組，表明七氟烷后處理改善了IRI大鼠的心肌血流。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠T1、T2、T4時的HR顯著低于T0時，T3、T5時的HR顯著高于T0時，T2、T3、T4、T5時的MAP顯著低于T0時，T2時的HR顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR顯著高于T1時，T2、T3、T4、T5時的MAP顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR顯著高于T2時，T3、T5時的MAP顯著低于T2時，T4時的MAP顯著高于T2時。說明對照組大鼠T0～T2時的HR和T1～T3的MAP明顯下降，可能與手術(shù)初期水合氯醛對大鼠心血管系統(tǒng)的抑制有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組大鼠T2、 T3、T4、T5時的HR和MAP顯著低于T0、T1時，T3、T4、T5時的HR和MAP顯著低于T2時，T4、T5時的HR顯著低于T3時，T5時的MAP顯著低于T3時，T5時的HR和MAP顯著低于T4時，說明缺血再灌注組大鼠T2～T5時的HR和MAP明顯下降，提示大鼠心肌IRI造模成功。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟烷組大鼠T1、T2、 T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T0時，T2、T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T1時，T3、T4、T5時的HR、MAP顯著低于T2時,T3、T4、T5時的HR、MAP比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明七氟烷組大鼠T1～T3時的HR、MAP明顯下降，而T3～T5時的HR、MAP變化不大，提示七氟烷使大鼠再灌注過程中血流動力學(xué)指標相對平穩(wěn)。

綜上所述，七氟烷后處理可改善IRI大鼠心肌的血流供應(yīng)，減少心肌標志物cTnI、LDH和CK-MB的釋放，改善再灌注后心肌損傷，對IRI的心肌有一定的保護作用。由于本研究樣本量有限，未對不同吸入濃度七氟烷對缺血再灌心肌影響做對比，可以進一步擴大樣本量研究不同濃度七氟烷對缺血心肌的影響，為臨床應(yīng)用提供更多的參考價值。