劉勇，李澤秀，唐良玉，鄧靖，張堯，余雨蓉，陳云華，趙學梅

貴州泰邦生物制品有限公司，貴州貴陽550025

靜注人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection，IVIG）是治療原發(fā)性免疫缺陷病、繼發(fā)性免疫缺陷病和自身免疫性疾?。ㄔl(fā)性血小板減少癥、川崎?。┑挠行幬铮?-4］。目前，國內上市的IVIG 制劑為IVIG（pH4），蛋白濃度為50g／L（5%IVIG），以糖類作為穩(wěn)定劑。高濃度IVIG 是采用層析工藝開發(fā)的新一代 IVIG 制劑［5］，蛋白濃度為 100 g ／L（10%IVIG），以氨基酸類作為穩(wěn)定劑，國內暫無產品上市。目前，10%IVIG 的研發(fā)已成為血液制品行業(yè)的焦點［6-7］。

選擇性IgA 缺乏癥（selective immunoglobulin A deficiency，SIgAD）是指患者血清 IgA 低于 0.05 g ／L，IgG 和IgM 含量正常，是免疫缺陷中最常見的類型，占原發(fā)性免疫缺陷病的60%以上。IgA 缺乏型患者可能因使用含IgA 的IVIG 制劑而產生抗-IgA，當再次輸入該類制品時可產生嚴重的過敏反應，甚至危及生命，因此，嚴格控制IVIG 中IgA 殘留量具有重要的臨床意義［8-9］，國外如Octaphama 公司內部標準要求 IVIG 制品 IgA 殘留量 ≤ 200 μg ／ mL［10］。

《中國藥典》三部（2020 版）已增加IVIG 中IgA殘留量檢測要求，檢測方法包括紫外-可見分光光度法、酶聯免疫法和散射比濁法 3 種［11］。10% IVIG 較5%IVIG 蛋白濃度高1 倍，更應關注制品中IgA 的殘留量。目前，紫外-可見分光光度法中所用抗人IgA 血清試劑批間質量尚存在一定的差異，為加快10%IVIGⅢ期臨床樣品IgA 殘留量檢測方法的建立，本研究對酶聯免疫法和散射比濁法進行驗證及比較。

1 材料與方法

1.1 供試品 高濃度IVIG 由貴州泰邦生物制品有限公司生產。

1.2 主要試劑及儀器 人IgA 測定試劑盒購自美國Immunology Consultants Laboratory，Inc 公司（ICL）；人腦脊液IgA 測定試劑盒購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH 公司；IgA 國際標準品（批號：67 ／ 086，規(guī)格：100 IU ／ 支，1 IU = 14.2 μg）購自NIBSC；全波長酶標儀購自美國賽默飛公司；BN Pro-Spec?全自動蛋白分析儀購自德國Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH ／西門子公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 酶聯免疫法 取ICL 試劑盒中樣品稀釋液進行5 倍稀釋，配制成樣品稀釋液，并將樣品 ／ 標準品按需求進行稀釋。取100 μL 標準品 ／ 樣品，室溫孵育 30 min；洗滌液洗板 3 次，加入 100 μL 酶標工作液，避光孵育30 min；洗滌液洗板3 次，加入100 μL TMB 顯色液，避光孵育 10 min；加入 100 μL 終止液，酶標儀450 nm 測定A 值，A450值與濃度進行四參數擬合，得到標準曲線，計算IgA 殘留量。

1.3.2 散射比濁法 IgA 試劑盒內定標液、質控品、檢測試劑、檢測輔助試劑按要求進行復溶，放入儀器指定位置；供試品經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取2 mL 濾液置于試管中，裝載上機檢測IgA 殘留量。

1.4 方法的驗證

1.4.1 線性與范圍

1.4.1.1 酶聯免疫法 將ICL 試劑盒內標準品按照試劑盒說明書用樣品稀釋液倍比稀釋，按1.3.1 項步驟檢測，驗證線性與范圍。

1.4.1.2 散射比濁法 將試劑盒內定標品裝載至全自動蛋白分析儀上，建立標準曲線方法，儀器自動按預設比例倍比稀釋，驗證線性與范圍。

1.4.2 準確度 采用加標回收率法。取復溶后的標準品溶液，分別稀釋至 6、12 和 18 μg ／ mL；將 10%IVIG 原液稀釋至濃度分別約為 6、12 和 18 μg ／ mL，作為供試品。將對應濃度的標準品和供試品按體積比1 ∶1 混合，分別制成3 個濃度水平的加標混合溶液，每個濃度制備3 份，分別采用酶聯免疫法和散射比濁法進行測定，按下式計算回收率，驗證方法的準確度。

回收率（%）=（加標供試品測定濃度-供試品測定濃度）／標準品理論濃度× 100%

1.4.3 重復性 分別采用酶聯免疫法和散射比濁法測定平行制備的6 份10% IVIG，并計算RSD，驗證方法的重復性。

1.4.4 中間精密性 不同試驗員于不同時間獨立采用酶聯免疫法和散射比濁法分別測定平行制備的6 份 10% IVIG 的 IgA 殘留量，并計算 RSD，驗證方法的中間精密性。

1.4.5 專屬性 取同一批次的2 份10%IVIG 樣品，分別采用酶聯免疫法和散射比濁法測定，樣品1 直接測定IgA 殘留量，樣品2 添加甘氨酸濃度至20 g ／ L再測定IgA 殘留量，各平行測定3 次，并計算RSD，驗證方法的專屬性。

1.5 兩種方法的比較 取3 批10% IVIG，分別采用酶聯免疫法和散射比濁法測定樣品中的IgA 殘留量，每個樣品平行制備3 份。

1.6 委外檢測比對 試制7 批次10% IVIG 的Ⅲ期臨床試驗藥物，完成公司自檢后，委托中國食品藥品檢定研究院檢測IgA 殘留量，進行比對分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 方法的驗證

2.1.1 線性與范圍

2.1.1.1 酶聯免疫法 IgA 濃度在2.5~800 ng／mL范圍內，以IgA 標準品A450值和濃度做四參數曲線擬合，IgA 與A450呈良好的線性關系，相關系數r 為0.999 96。見圖1。

圖1 酶聯免疫法標準曲線Fig.1 Standard curve of ELISA

2.1.1.2 散射比濁法 以IgA 的濃度0.261~8.35mg／L與散射光強度值求得直線回歸方程，標準曲線均值偏差為0.56%，見圖2。

圖2 散射比濁法標準曲線Fig.2 Standard curve of nephelometry assay

2.1.2 準確度 酶聯免疫法和散射比濁法測定不同濃度水平樣品的平均加標回收率（n = 9）分別為103.32%和89.82%，見表1。表明兩種方法受樣品基質影響小，能夠準確測定10%IVIG 中IgA 的殘留量。

表1 兩種方法的回收率測定結果Tab.1 Determination results of recoveries by two methods

2.1.3 重復性 酶聯免疫法和散射比濁法重復測定10%IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為4.90%和5.05%，均小于8%，見表2。表明兩種方法重復性良好。

表2 兩種方法的重復性驗證結果Tab.2 Verification for reproducibility of two methods

2.1.4 中間精密性 酶聯免疫法和散射比濁法測定10% IVIG IgA 殘留量的RSD 分別為5.88%和5.42%，均小于8%，見表3。表明兩種方法中間精密性良好。

表3 兩種方法的精密性驗證結果Tab.3 Verification for precision of two methods

2.1.5 專屬性 酶聯免疫法和散射比濁法測定結果的均值分別為 9.38 和 7.28 μg ／ mL，RSD 分別為6.14%和4.3%，見表4。表明甘氨酸輔料對IgA 檢測干擾較小。

表4 兩種方法的專屬性驗證結果Tab.4 Verification for specificity of two methods

2.2 兩種方法的比較 酶聯免疫法與散射比濁法相比，測定IgA 殘留量偏高，兩種方法平行測定的結果穩(wěn)定性良好，兩種方法檢測結果差異無統(tǒng)計學意義（t = 1.311，P = 0.260）。見表 5。

表5 兩種方法檢測結果的比較Tab.5 Determination results by two methods

2.3 委外檢測結果 委外檢驗10% IVIG 的IgA 殘留量略低于企業(yè)自檢結果，見表6。

表6 委外檢測與企業(yè)自檢結果比對（μg ／ mL）Tab.6 Determination results by two laboratories（μg ／ mL）

3 討 論

本研究通過酶聯免疫法和散射比濁法檢測10%IVIG 中IgA 殘留量，并驗證兩種檢測方法的線性范圍、準確度、重復性、中間精密性、專屬性均符合藥典要求，兩種方法的檢測結果差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），但酶聯免疫法較散射比濁法檢測結果略高，這可能與供試品IgA 含量較低有關，有一定的誤差，今后需進一步深入研究。

采用兩種方法檢測試制7 批次的高濃度IVIGⅢ期臨床試驗藥物中的IgA 殘留量略高于中國食品藥品檢定研究院檢測結果，這可能與不同實驗室采用的檢測試劑盒、儀器不同有關，后續(xù)還需進行多批次對比分析。高濃度IVIGⅢ期臨床試驗藥物中的IgA 殘留量遠低于 200 μg ／ mL。

已有研究報道國內廠家已上市的IVIG（pH 4）IgA均值約 150 μg ／ mL，部分廠家接近 400 μg ／ mL［12］。IgA 是IVIG 中重要的安全性指標，本研究檢測的新型高濃度IVIG 中雜蛋白IgA 含量極低，能有效降低副作用，臨床使用更加安全［9］。

《中國藥典》三部（2020 版）中規(guī)定的3 種測定方法原理均是基于IgA 與相應的抗體特異性結合，與酶聯免疫法和散射比濁法所用的包被IgA 特異性抗體的酶標板和顆粒不同，紫外-可見分光光度法使用的試劑是抗人IgA 血清（應為全血清經一定純化技術分離制得的特異性抗體），而目前國內抗人IgA血清試劑批間質量尚存在一定差異，因此暫未系統(tǒng)地開展該方法驗證。

酶聯免疫法具有簡便、快速、靈敏、精確等優(yōu)點而被廣泛使用，更易于實驗室操作［13］；散射比濁法所使用的全自動蛋白分析儀更多地應用于醫(yī)療機構臨床檢驗，檢測時間短于酶聯免疫法，但對于IgA 含量較低的IVIG 檢測時需使用人腦脊液IgA 測定試劑盒，費用相對較高。《中國藥典》三部（2020 版）規(guī)定，首次采用本法檢測供試品中IgA 殘留量時，應根據不同樣品基質及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法，并進行相應的驗證［11］。

綜上所述，本研究結果表明，酶聯免疫法和散射比濁法均可用于高濃度IVIG 中IgA 殘留量的質量控制，基于檢測費用成本考慮，同時多批次酶聯免疫法檢測結果略高于散射比濁法，參考風險評估原則，企業(yè)對于IgA 含量極低的10% IVIG 中IgA 殘留量進行放行檢測時，更推薦使用酶聯免疫法。此外，參考《中國藥典》，企業(yè)也可根據研制的10% IVIG 樣品基質及IgA 殘留量的水平選擇適宜的測定方法。