杜麗芳，侯亞楠，雷澤華，袁潤(rùn)余，梁宇，韓子泊，唐芳，李啟明

1.國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院，北京101111；2.廣東省疾病預(yù)防控制中心，廣東廣州511430

新型冠狀病毒是β 屬冠狀病毒，為單股正鏈RNA 病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑60 ~140 nm，人群普遍易感，主要經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播，污染物品及氣溶膠也具有傳播風(fēng)險(xiǎn)。多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重甚至死亡，多見于老人、有慢性基礎(chǔ)疾病人群、晚期妊娠和圍產(chǎn)期女性、肥胖人群［1-4］。新型冠狀病毒自發(fā)現(xiàn)以來(lái)迅速在全球蔓延，并在全球范圍內(nèi)持續(xù)流行。WHO 官網(wǎng)顯示，截至2021 年11 月12 日，全球共有251 788 329人確診為新型冠狀病毒肺炎，其中有5 077 909 人死亡［5］。

新型冠狀病毒感染人體的關(guān)鍵在于S 蛋白與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2 ACE2）蛋白的結(jié)合。兩者結(jié)合后，存在于宿主細(xì)胞表面的Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（transmembrane protease serine 2，TMPRSS2）清除 ACE2 并激活 S 蛋白，S 蛋白的激活導(dǎo)致構(gòu)象改變，并允許病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。細(xì)胞膜上的外肽酶TMPRSS2 和細(xì)胞內(nèi)的組織蛋白酶 cathepsin B ／ L 將 S 蛋白的 S1 ／ S2 切開［6］。因此S 蛋白是病毒進(jìn)入的主要決定因素，也是藥物治療、疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)［7］。

本研究利用中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞重組表達(dá)新型冠狀病毒S 蛋白受體結(jié)合區(qū)（RBD）蛋白制備的重組新型冠狀病毒疫苗，免疫大鼠后，采用不同方法檢測(cè)大鼠血清中特異性IgG 抗體和中和抗體水平，以分析不同檢測(cè)方法的相關(guān)性和一致性，為疫苗有效性評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí) Wistar 大鼠，6 ~ 8 周齡，體重150 ~ 200 g，共40 只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：110324201102113753。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行Wistar 大鼠的養(yǎng)殖和使用，且按照《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查指南》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 新型冠狀病毒假病毒及野病毒 假病毒（包含新型冠狀病毒S 蛋白的VSVΔG 病毒）由中國(guó)食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室提供，其中S 蛋白基因序列來(lái)自Wuhan-Hu-1 毒株（GenBank 序列號(hào)：MN908947），報(bào)告基因?yàn)槲灮鹣x熒光素酶；野病毒由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，分離自廣東省，病毒株編號(hào)為2020XN4276 株。

1.3 疫苗及細(xì)胞 重組新型冠狀病毒疫苗由國(guó)藥中生生物技術(shù)研究院制備并提供；Huh-7 細(xì)胞由中國(guó)食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室提供；Vero-E6 細(xì)胞由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.4 主要試劑 RBD 蛋白購(gòu)自北京義翹神州科技股份有限公司（貨號(hào)：40592-V08B）；HRP 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：ZB2305）；鋁佐劑購(gòu)自丹麥Croda Denmark（貨號(hào)：21645-51-2）。

1.5 動(dòng)物免疫 將Wistar 大鼠分為5 組，每組8 只。1 ~ 3 組免疫劑量分別為 10、20 和 40 μg ／ 劑，共接種 3 劑（第 0、3、6 周）；4 組免疫劑量為 20 μg ／ 劑，共接種 2 劑（第 0、3 周）；5 組為陰性對(duì)照組，接種 3劑鋁佐劑。均經(jīng)肌肉注射，0.5 mL ／ 只（雙側(cè)后腿各0.25 mL），免疫1 周后經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，每周1 次，共7 次。檢測(cè)特異性IgG 抗體和中和抗體水平，共檢測(cè)280 份血清樣本。

1.6 特異性IgG 抗體水平檢測(cè) 采用ELISA 法。將RBD 蛋白稀釋至 1 μg ／mL，包被酶標(biāo)板，100 μL ／孔，2 ～8 ℃孵育10 ~ 12 h；用含20%牛血清的稀釋液封閉2 h；免疫血清進(jìn)行系列稀釋（初始稀釋度為1 ∶100）后加至酶標(biāo)板中，100 μL ／ 孔，37 ℃孵育 1 h；洗板，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG（1 ∶10 000稀釋），100 μL ／ 孔，37 ℃孵育 1 h；洗板，顯色并讀取吸光度值（A450／630）。特異性IgG 抗體效價(jià)為 ≥ cutoff 值的血清最高稀釋度的倒數(shù)。

1.7 中和抗體水平檢測(cè)

1.7.1 假病毒微量中和試驗(yàn) 將待測(cè)血清樣本進(jìn)行系列稀釋（初始稀釋度為 1 ∶40），取 50 μL 稀釋后血清與50 μL 新型冠狀病毒假病毒［工作濃度為（1 ~ 2）× 104TCID50／ m L］混合，37 ℃孵育 1 h；將Huh-7 細(xì)胞懸液（2 × 105個(gè) ／ mL）加至含有血清和假病毒混合液的 96 孔培養(yǎng)板中，100 μL ／ 孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（不含假病毒）和陰性對(duì)照（含假病毒），37 ℃培養(yǎng)20 ~ 28 h。根據(jù)各孔R(shí)LU 值，采用Reed-Muench 法計(jì)算50%感染抑制率時(shí)血清稀釋倍數(shù)，即為該血清樣品的中和抗體滴度。

1.7.2 野病毒微量中和試驗(yàn) 該試驗(yàn)在廣東省疾病預(yù)防控制中心BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。將待測(cè)血清樣本進(jìn)行系列稀釋（初始稀釋度為 1 ∶40），取 60 μL 稀釋后血清與60 μL 新型冠狀病毒野病毒（2 × 103TCID50／mL）混合，37 ℃孵育2 h；取 100 μL 血清與野病毒的混合液加至含 Vero-E6 細(xì)胞（2 × 105個(gè) ／ mL）的 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（不含野病毒）和陰性對(duì)照（含野病毒），37 ℃培養(yǎng)5 ～7 d。觀察細(xì)胞病變情況，采用Karber 法計(jì)算50%感染抑制率時(shí)血清稀釋倍數(shù)，即為該血清樣品的中和抗體滴度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Spearman 秩相關(guān)對(duì)3 種方法進(jìn)行相關(guān)性分析，采用kappa 檢驗(yàn)對(duì)3 種方法進(jìn)行一致性分析（kappa ≥ 0.75，兩者一致性好；0.75>kappa ≥ 0.4，兩者一致性一般；kappa < 0.4，兩者一致性較差）。以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 相關(guān)性分析 ELISA 法與假病毒微量中和試驗(yàn)、野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性均良好（rs分別為 0.926 和 0.884，P < 0.05），假病毒微量中和試驗(yàn)與野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性也良好（rs= 0.925，P < 0.05），見圖 1。將各組檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，各組內(nèi)不同檢測(cè)方法的相關(guān)性均良好（rs> 0.750，P <0.05），見表1。表明不同方法檢測(cè)結(jié)果均具有良好的相關(guān)性。

圖1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.1 Correlation of determination results by different methods

表1 各組內(nèi)不同檢測(cè)方法的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation of determination results by different methods in various groups

2.2 一致性分析 ELISA 法與假病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.899，總符合率為95.71%；ELISA 法與野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.759，總符合率為88.93%；假病毒微量中和試驗(yàn)與野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的一致性分析kappa 值為0.824，總符合率為91.79%，見表2 ~ 4。表明不同方法檢測(cè)結(jié)果的一致性均較好。對(duì)3 種方法不同采血時(shí)間樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，結(jié)果顯示，不同方法一致性程度與采血時(shí)間點(diǎn)有一定相關(guān)性，見表5。

表2 假病毒微量中和試驗(yàn)與ELISA 法檢測(cè)結(jié)果的一致性分析（例數(shù)）Tab.2 Consistency of determination results by pseudovirus neutralization test and ELISA（number of cases）

表3 野病毒微量中和試驗(yàn)與ELISA 法檢測(cè)結(jié)果的一致性分析（例數(shù)）Tab.3 Consistency of determination results by wild virus neutralization test and ELISA（number of cases）

表4 野病毒微量中和試驗(yàn)與假病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的一致性分析（例數(shù)）Tab.4 Consistency of determination results by wild virus neutralization test and pseudovirus neutralization test （number of cases）

表5 不同方法檢測(cè)不同采血時(shí)間點(diǎn)樣本的一致性分析Tab.5 Consistency of determination results of samples determined by different methods at different time points

3 討 論

為應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒肺炎大流行，全球出臺(tái)了多項(xiàng)疫情防控措施并積極組織開展疫苗研發(fā)，病毒基因序列的公布更加快了新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)速度。截至2021 年11 月16 日，全球共計(jì)194 個(gè)新型冠狀病毒疫苗處于臨床前研究階段，132 個(gè)新型冠狀病毒疫苗正在進(jìn)行臨床研究，8 個(gè)新型冠狀病毒疫苗獲得緊急使用授權(quán)［8］。新型冠狀病毒的中和抗體是建立保護(hù)性免疫的關(guān)鍵，因此，疫苗的免疫原性分析，尤其是中和抗體分析，對(duì)于疫苗效力評(píng)價(jià)非常重要［9］。

在不同種類新型冠狀病毒疫苗臨床研究中，特異性IgG 抗體和中和抗體水平檢測(cè)均是疫苗免疫原性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)［10-12］。其中特異性IgG 抗體檢測(cè)靶標(biāo)主要針對(duì)S 蛋白或N 蛋白［13］，中和抗體檢測(cè)主要采用假病毒或野病毒中和試驗(yàn)。

野病毒噬斑減少中和試驗(yàn)是檢測(cè)中和抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)于新型冠狀病毒中和抗體的檢測(cè)，其不僅檢測(cè)通量低，耗時(shí)長(zhǎng)，且需在BSL-3 級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。假病毒微量中和試驗(yàn)可彌補(bǔ)野病毒微量中和試驗(yàn)環(huán)境及設(shè)備的限制，在BSL-2 級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，且耗時(shí)短［9］。臨床上基于抗原抗體結(jié)合原理的檢測(cè)方法有化學(xué)發(fā)光法、ELISA 法和免疫熒光法等，其中ELISA法是經(jīng)典的血清學(xué)檢測(cè)方法，由于其檢測(cè)成本低，耗時(shí)短，檢測(cè)通量相對(duì)較大，適合用于產(chǎn)品開發(fā)階段的抗體評(píng)價(jià)［13］。

本研究將重組新型冠狀病毒疫苗免疫大鼠，采用ELISA 法、假病毒微量中和試驗(yàn)和野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清特異性IgG 抗體和中和抗體水平，結(jié)果顯示，不同方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性良好，這對(duì)新型冠狀病毒疫苗的早期研究具有重要指導(dǎo)意義。相比較而言，ELISA 法與野病毒微量中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性、一致性相對(duì)較低，分析其原因?yàn)椋孩俨煌椒ǖ臋z測(cè)靈敏度存在差異，部分IgG抗體結(jié)合的抗原表位非中和表位［14-15］；②與抗體親和力有關(guān)。檢測(cè)結(jié)果不一致樣本多為初次免疫后1或2 周的血清樣本，此時(shí)還未完成抗體親和力成熟的過(guò)程，因此抗體親和力及中和活性相對(duì)較低［16］。

綜上所述，特異性IgG 抗體和中和抗體均是反映保護(hù)效果的重要指標(biāo)，針對(duì)新型冠狀病毒中和抗體是建立保護(hù)性免疫的關(guān)鍵，因此在不具備BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室的條件下，3 種檢測(cè)方法的相關(guān)性對(duì)于疫苗的早期研發(fā)及概念性驗(yàn)證階段具有重要指示意義。

志謝感謝中國(guó)食品藥品檢定研究院性病與艾滋病室在假病毒中和試驗(yàn)中提供的幫助