孫雨晴，王宇飛，宋美燕，張娟，張麗，李美寧，白云，劉志貞

1.山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山西太原030000；2.山西省婦幼保健院婦產(chǎn)科，山西太原030000

世界衛(wèi)生組織預(yù)計，2012 年我國出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，特別是山西省呂梁市柳林縣及臨縣，發(fā)病率可高達10%［1］。其中神經(jīng)管畸形（neural tube defects，NTDs）是一類常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出生缺陷相關(guān)疾病，發(fā)病率位居出生缺陷疾病的第2 位，僅次于先天性心臟病［2-3］，主要臨床表現(xiàn)為腦膨出、無腦兒及脊柱裂。圍產(chǎn)期每天增補4 mg 葉酸已作為降低NTDs 發(fā)生率的主要有效預(yù)防措施［4］。鑒于NTDs發(fā)病機制的復(fù)雜性和不確定性，對其研究尚無明確報道。因此，探索NTDs 的發(fā)病原因具有十分重要的社會價值和研究意義。

微小 RNA（miRNA）是長度約為 22 個核苷酸（NT）的非編碼 RNA，通過與靶mRNA 的3′UTR 序列特異互補結(jié)合調(diào)節(jié)下游目標(biāo)基因表達，導(dǎo)致mRNA 降解或翻譯抑制，人類基因約有 1 ／ 2 mRNA 受 miRNA 調(diào)控［5］。miRNA 已被證實廣泛參與細胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)育、細胞生長分化和凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、代謝或形態(tài)發(fā)生等重要生命活動過程［6-9］；在神經(jīng)細胞譜系的決定、突觸和神經(jīng)發(fā)生等神經(jīng)生物學(xué)等方面同樣發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］；目前研究表明，miRNAs 參與調(diào)控神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）分化和哺乳動物的腦發(fā)育［11-14］。大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-222-3p 在乳腺癌、甲狀腺癌和腦膠質(zhì)瘤等的細胞增殖、遷移和分化過程中發(fā)揮顯著的調(diào)控作用［15-18］，但在NTDs 發(fā)生過程中的相關(guān)研究尚未見報道。miR-222-3p 下游Ddit4 基因被稱為氧化應(yīng)激基因，屬于DDIT（DNA damage inducible transcript）或GADD（growth arrest DNA damage）蛋白家族［19］。人和小鼠的 Ddit4 蛋白在其 C-端相當(dāng)保守，均含有RTP801_C 蛋白結(jié)構(gòu)域，序列一致性可達61%，研究也發(fā)現(xiàn)，其同源基因scylla 和charybde 參與果蠅頭部發(fā)育［19］。既往許多研究表明，Ddit4 在腫瘤發(fā)生發(fā)展、胚胎發(fā)育等生理過程中發(fā)揮重要作用［20］，但對于如何調(diào)控Ddit4 表達，進而參與疾病的機制尚未闡明。

本實驗室前期miRNA-Seq 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-222-3p 及其下游靶基因 Ddit4 在 C57BL ／ 6 小鼠正常胚胎腦組織和全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)的NTDs 胚胎腦組織存在差異表達［21］?；诖?，本研究首先利用ATRA 誘導(dǎo)小鼠NTDs 模型，再通過生物信息學(xué)方法及雙熒光素酶檢測分析miR-222-3p 與Ddit4 基因之間是否為靶向關(guān)系，以期了解miR-222-3p 在大腦發(fā)育中的功能。

1 材料與方法

1.1 細胞、載體及基因組DNA HT-22 細胞株購自廣州吉妮歐細胞庫；miR-222-3p 模擬物（miRNA mimics）及其陰性對照（mimis NC）、293T 基因組 DNA 均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；帶GFP 的Ddit4 空載體和小鼠源GP-miRGLO 購自中國GenePharma 公司。

1.2 主要試劑及儀器 ATRA 購自美國Sigma 公司；蛋白胨（tryptone）及酵母提取物（yeast extract）購自英國OXOID 公司；瓊脂糖、Universal DNA Purification Kit、DNA 純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Phusion DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XhoⅠ和普通DNA 聚合酶均購自美國Fermentas公司；ClonExpress?Entry One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DualGlo?Luciferase Assay System 購自美國Promega 公司；體式顯微鏡購自日本Olympus 公司；10%胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；LipofectmineTM2000 購自美國Invitrogen 公司。

1.3 實驗動物 清潔級 C57BL ／ 6 成年小鼠，8 ～ 12周齡，體重22 g 左右未繁殖發(fā)情期雌鼠和體重26 g左右的雄性小鼠，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物合格證號為SCXK（晉）2015-0001。本實驗對小鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進行。

1.4 小鼠NTDs 模型的建立 研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)管閉合的關(guān)鍵時點為E8.5 ～E10.5［22］。本課題組前期通過 ATRA 建立 NTDs 模型［23］，測序結(jié)果也顯示［21］，與對照組相比，畸形組miR222-3p ／ Ddit4 表達異常，表明miR222-3p／Ddit4 參與了神經(jīng)管的發(fā)育。因此，本實驗選擇在E7.5 給藥建模，E10.5 處死孕鼠，分離完整胚胎。將雌鼠及雄鼠于下午6：00 進行合籠交配，次日8：00 分籠，陰栓及體重增加的雌鼠作為孕鼠，中午 12：00 即為 E0.5，E7.5 時，將配制好的ATRA 按照 28 mg ／ kg 劑量灌胃，灌入等劑量的香油作為正常對照組。小鼠懷孕至E10.5，通過頸椎脫臼法處死孕鼠，將其泡入75%乙醇，沿其腹中線剪開腹部暴露子宮，用鑷子夾取串珠狀子宮，剪下放入PBS緩沖液中清洗，而后在體式顯微鏡下依次剝離子宮壁、虹膜組織、Reichart’s 膜、羊膜后，分離出完整胚胎。觀察剝離的對照組和畸形組胚胎的差異，拍照。

1.5 Ddit4 野生型（WT）和突變型（MUT）雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 通過Targetscan、PicTar、miRanda 及PITA、miRDB 等生物信息學(xué)軟件篩選出得分較高，且交集較多的靶基因，結(jié)合前期測序結(jié)果選擇Ddit4 靶基因。進一步利用PCR 法，按照3′UTR Ddit4（mmu）序列信息設(shè)計其擴增引物，以293T基因組 DNA 為模板，PCR 擴增 Ddit4 基因的 3′UTR序列，將其克隆至小鼠源GP-miRGLO。提取健康小鼠全血基因組DNA，以其為模板，PCR 擴增含miR-222-3p 結(jié)合位點的 Ddit4 3′UTR 區(qū)域，分別于 PCR 引物5′及 3′端添加 SacⅠ和 XhoⅠ酶切位點。Ddit4 正向引物：5′-CCTTAGGAGTCACACAGGCTTCTGGCTGGATGTGTATGTAGCATGTACCTTATTTTTTTTTATTACTGACAC-3′，反向引物：5′-TCGAGTGTCAGTAATAAAAAAAAATAAGGTACATGCTACATACACATCCAGCCAGAAGCCTGTGTGACTCCTAAGGAGCT-3′；根據(jù)野生型序列將 miRNA-222-3p 與 Ddit4 3′UTR 區(qū)域特異性結(jié)合部位堿基變?yōu)闊o意義序列，設(shè)計特異定點突變引物。正向引物：5′-CCTTAGGAGTCACACAGGCTTCTGGCTGGATGTGTTACATCGATGTACCTTATTTTTTTTTATTACTGACAC-3′，反向引物：5′-TCGAGTGTCAGTAATAAAAAAAAATAAGGTACATCGATGTAACACATCCAGCCAGAAGCCTGTGTGACTCCTAAGGAGCT-3′。用SacⅠ和XhoⅠ對載體GP-miRGLO 37 ℃酶切2 h，瓊脂糖凝膠電泳線性化后，用DNA 凝膠回收試劑盒回收載體條帶，用T4 DNA ligase 與退火得到的雙鏈模板22 ℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的大腸埃希菌感受態(tài)細胞，挑選 4 個克隆菌落，置于 5 mL LB 培養(yǎng)基（含 50 μg ／mL Amp）中，37 ℃，250 r ／ min 搖床培養(yǎng) 16 h。用質(zhì)粒小提試劑盒抽提菌液質(zhì)粒，送上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司測序。將測序結(jié)果與目的基因序列進行比對，確認(rèn)其序列一致后，將保存的甘油菌液接種LB培養(yǎng)基，進行質(zhì)粒大量抽提，獲得重組質(zhì)粒。

1.6 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清和1%雙抗（100 U ／ mL 青霉素，100 μg ／ mL 鏈霉素）的 DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HT-22 細胞。用 LipofectmineTM2000 將帶 GFP 的 Ddit4空載體按 2.08 μg ／ 孔（6 孔板）轉(zhuǎn)染 HT-22 細胞，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.7 雙熒光素酶活性檢測 HT-22 細胞培養(yǎng)24 h后，按照每孔1.5×104個接種于96 孔板中，取75 μL不含血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，加入2.5 μL miR-222-3p 模擬物（miRNA mimics）或 miR-222-3p 陰性對照（mimis NC），75 μL（25 μL ／ 孔）無血清培養(yǎng)基加入0.8 μL Ddit4 3′UTR 雙熒光素酶報告基因WT或 MUT 質(zhì)粒，75 μL 不含血清及雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基加入 0.3 μL LipofectamineTM2000 試劑，3 者混合5 min，搖勻，室溫作用 20 min；將 WT 或 MUT 質(zhì)粒、miRNA mimics 或 mimis NC 加入細胞前，吸棄 50 μL培養(yǎng)基，加入上述混合液50 μL，其中轉(zhuǎn)染濃度mimics均為 20 μmol ／ L，質(zhì)粒為 130 ng ／ 孔，每組設(shè) 3 個重復(fù)。6 h 后更換100 μL 新鮮培養(yǎng)基；檢測熒光前，將試劑盒的Dual-Glo buffer + Dual-Luciferase substrate混合后配成Dual-Glo & Luciferase Reagent 后分裝，-80 ℃貯存，使用前解凍至室溫。Dual-Glo & stop &Glo buffer-20 ℃貯存，現(xiàn)配現(xiàn)用。轉(zhuǎn)染48 h 后，吸出25 μL 培養(yǎng)基，加入 75 μL Dual-Glo&Luciferase Reagent，搖床等待至少10 min 使細胞裂解，然后檢測螢火蟲熒光素的發(fā)光強度；檢測后加入75 μL Dual-Glo&stop&Glo Reagent，置于搖床上，等待至少10 min，檢測海腎熒光素的發(fā)光強度；最后收集和分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩個樣本均數(shù)間差異比較采用t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)作圖使用GraphPad Prism 8 軟件。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠NTDs 模型的建立及miR-222-3p 的表達水平 體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，畸形組小鼠胚胎有明顯的前腦及后腦畸形，表明此劑量ATRA 確能使C57BL ／ 6 小鼠神經(jīng)管畸形，側(cè)面證實了前期測序結(jié)果真實可用，并提示miR222-3p ／ Ddit4 參與了神經(jīng)管的發(fā)育，可進行后續(xù)驗證。

圖1 體式顯微鏡觀察兩組小鼠E10.5 胚胎（× 50）Fig.1 Stereomicroscopy of E10.5 of mice in two groups（× 50）

2.2 miR-222-3p 與 Ddit43′UTR 互補結(jié)合位點及雙熒光素酶報告基因構(gòu)建質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)生物信息學(xué)軟件篩選，發(fā)現(xiàn) miR-222-3p 與 Ddit4 3′UTR 存在互補結(jié)合位點，見圖2。載體具有雙熒光素酶位點，可用于后續(xù)雙熒光素酶試驗，見圖3。測序結(jié)果顯示，WT 型和MUT 型質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖4。1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒GP-miRGLO-Ddit4-WT 和 GP-miRGLO-Ddit4-MUT 經(jīng) SacⅠ和 XhoⅠ雙酶切，均可見約70 bp 的目的片段，見圖5。

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測miR-222-3p 與Ddit4 結(jié)合位點Fig.2 Bioinformatics prediction of binding sites of miR-222-3p and Ddit4

圖3 Ddit4 雙熒光素酶載體圖Fig.3 Dual luciferase vector for Ddit4

圖4 Ddit4-WT（A）和 Ddit4-MUT（B）質(zhì)粒測序結(jié)果Fig.4 Sequencing of Ddit4-WT（A）and Ddit4-MUT（B）plasmids

圖5 WT 型和MUT 型重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定（SacⅠ／XhoⅠ）Fig.5 Restriction map of WT and MUT recombinant plasmids（SacⅠ／ XhoⅠ）

2.3 轉(zhuǎn)染效率 倒置熒光顯微鏡下觀察可見，GFP的表達隨時間增加而增強，至48 h 熒光表達強度基本穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率達90%以上，見圖6。

圖6 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后GFP 表達（× 100）Fig.6 Fluorescence microscopy of GFP expression after transfection（× 100）

2.4 雙熒光素酶活性 空白對照組Ddit4-PC 轉(zhuǎn)染mimis NC 和mimis-miR-222-3p 后，熒光素酶活性無顯著變化（t=0.357 9，P=0.497 246）；Ddit4-WT+mimismiR-222-3p 組與Ddit4-WT + mimis NC 內(nèi)參組相比，熒光素酶活性明顯降低（t = 21.85，P = 0.000 026），表明mimis-miR-222-3p 能抑制野生型Ddit4 質(zhì)粒熒光素酶活性；而Ddit4-MUT + mimis-miR-222-3p 組與Ddit4-MUT+mimis NC 內(nèi)參組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 1.619，P = 0.180 782），進一步表明mimismiR-222-3p 無法抑制突變型Ddit4 質(zhì)粒熒光素酶活性。見圖7。

圖7 雙熒光素酶活性分析Fig.7 Analysis of activity of dual luciferase

3 討 論

microRNAs 主要在基因表達和蛋白質(zhì)翻譯過程中起調(diào)控因子的作用，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控樞紐的作用［24-25］，其通過轉(zhuǎn)錄后水平結(jié)合下游靶基因3′UTR 區(qū)域進而沉默下游靶基因，從而發(fā)揮其調(diào)控作用。前期研究表明，包括miR-222-3p 在內(nèi)的多種microRNAs 參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、NTDs 的發(fā)生發(fā)展［26-27］。本研究結(jié)果表明，在NTDs 小鼠胚胎腦組織中，miR-222-3p 表達降低且下游靶基因Ddit4 表達增加。因此，證實Ddit4 為miR-222-3p 靶向調(diào)控的基因，該結(jié)果對于明確miR-222-3p 在NTDs 發(fā)生發(fā)展中的作用機制，開發(fā)NTDs 個體化治療新的分子靶點具有重要價值。

本實驗首先利用多個靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫查詢得出Ddit4 可能是miR-222-3p 的下游靶基因，但microRNAs 對下游靶基因是否存在調(diào)控作用尚需進一步證實。HT-22 細胞是一種小鼠海馬神經(jīng)元細胞系，目前已應(yīng)用于多種中樞神經(jīng)疾病的研究中。因此，本實驗選則該細胞系，采用雙熒光素酶試驗來進一步驗證，將含有miR-222-3p 結(jié)合靶位點3′UTR 的Ddit4基因目的片段克隆插入雙熒光素酶載體中的SacⅠ、XhoⅠ位點，經(jīng)SacⅠ和XhoⅠ雙酶切及測序后證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。此外，本實驗結(jié)果表明，miR-222-3p表達增加可明顯抑制雙熒光素酶熒光活性。將Ddit4基因 mRNA 3′UTR 的 miR-222-3p 種子序列結(jié)合位點內(nèi)的7 個堿基進行定點突變后，發(fā)現(xiàn)過表達miR-222-3p 后，熒光強度未明顯改變。上述結(jié)果表明，miR-222-3p 能夠直接作用于 Ddit4 的 3′UTR 區(qū)，對其產(chǎn)生負性調(diào)控作用。而Ddit4 基因在帕金森阿爾茲海默癥等退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，參與調(diào)節(jié)作用［28-29］；Ddit4 還可能參與細胞增殖、細胞周期調(diào)控、胚胎背腹部發(fā)育、細胞凋亡誘導(dǎo)等生理過程［30-32］。

綜上所述，本研究首次成功構(gòu)建了Ddit4 基因雙熒光素酶載體，并證實了Ddit4 與miR-222-3p 存在靶向關(guān)系，這些結(jié)果對miR-222-3p 在大腦發(fā)育中的功能提供了的新認(rèn)識，并給疾病和神經(jīng)生物學(xué)帶來了深遠的影響。