安歡歡 ，錢莎莎 ，于代冠 ，申碩 ，2，3

1.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北武漢430207；2.國家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430207；3.湖北省疫苗技術(shù)創(chuàng)新中心，湖北武漢430207

2019 年12 月，中國湖北省武漢市監(jiān)測發(fā)現(xiàn)不明原因新型冠狀病毒肺炎，簡稱“新冠肺炎”。2020 年2 月 11 日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式將此新冠肺炎命名為2019 年冠狀病毒?。–oronavirus Disease 2019，COVID-19）。國際病毒分類學(xué)委員會（The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將引起 COVID-19 的病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARS-CoV-2）［1］。新冠肺炎已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并按照甲類傳染病管理，其具有傳染性強、潛伏期長、傳播途徑復(fù)雜等特點，感染患者的臨床病征表現(xiàn)為發(fā)燒、呼吸道癥狀、嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病和肺炎［2］。

SARS-CoV-2 是單股正鏈RNA 病毒，基因組長度約為29 800 bp，擁有已知RNA 病毒中最大的基因組。SARS-CoV-2 基因組結(jié)構(gòu)遵循冠狀病毒（coronaviruses，CoVs）已知的特定基因特征，5′端具有帽子結(jié)構(gòu)，3′端具有多聚腺苷酸尾巴。SARS-CoV-2 基因組含有10 個開放閱讀框（opening reading frame，ORF），可能共編碼至少 29 種蛋白質(zhì)［3］。位于基因組5′端且超過 2 ／ 3 的區(qū)域含有 1 個具有移碼重疊位點的ORF，稱為ORF1ab，翻譯可生成兩條多聚蛋白pp1a 和pp1b，后者通過核糖體移碼機(jī)制進(jìn)行翻譯，并由病毒編碼的蛋白酶（main protease 和papain-like protease）剪切加工生成16 個非結(jié)構(gòu)蛋白（分別命名為 NSP1 ~ NSP16），組裝釋放復(fù)制-轉(zhuǎn)錄復(fù)合體［4］。位于基因組3′端的1 ／ 3 區(qū)域編碼4 種病毒結(jié)構(gòu)蛋白，包括刺突糖蛋白（spike glycoprotein，S）、包膜蛋白（envelope protein，E）、膜蛋白（membrane protein，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）。此外，SARS-CoV-2 基因組3′端還編碼每個CoV 特有的種屬特異性輔助蛋白，分別為ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b 和 ORF10，由 3′端一系列亞基因組 mRNAs（subgenomic mRNAs，sgmRNAs）表達(dá)［5］。其中一些輔助蛋白裝配于病毒顆粒，如3a 在SARSCoV 被發(fā)現(xiàn)為結(jié)構(gòu)蛋白［6］，3a 在 SARS-CoV-2 的分子數(shù)與分子數(shù)豐度最高的結(jié)構(gòu)蛋白M 相當(dāng)［7］。

反向遺傳學(xué)（reverse genetics）是通過其表型變化來確定該基因功能的遺傳學(xué)研究方法。因為對非逆轉(zhuǎn)錄RNA 病毒而言，其復(fù)制表達(dá)的過程不會形成DNA 中間體，而目前絕大多數(shù)高效的分子生物學(xué)技術(shù)均是針對DNA 進(jìn)行操作［8］。由于CoV 基因組是RNA 病毒中已知最大的基因組，且其攜帶的復(fù)制酶基因以cDNA 克隆形式在細(xì)菌中增殖時存在不穩(wěn)定性，加上體外合成全長轉(zhuǎn)錄本難度大，使得CoV 全長感染性cDNA 的構(gòu)建受到極大的阻礙［9］。為了克服這些困難，目前已建立3 種不同于傳統(tǒng)途徑的創(chuàng)新性研究方法來建立CoV 的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，包括cDNA 片段的體外連接［10］、細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosomes，BACs）的使用［11］及以痘病毒為載體進(jìn)行 CoV 全長 cDNA 的增殖［12］。

為了更好地研究SARS-CoV-2 基因組的結(jié)構(gòu)與功能以及快速應(yīng)對目前所出現(xiàn)的多種變異株，其全長感染性cDNA 的構(gòu)建必不可少。本研究采用 In-Fusion、Gibson Assembly 以及 Recombineering技術(shù)對SARS-CoV-2 基因組進(jìn)行全長cDNA 的構(gòu)建［13］，區(qū)別于傳統(tǒng)的酶切連接方法。本研究可為大基因組病毒如CoV 的全長cDNA 構(gòu)建提供全新思路，也可為SARS-CoV-2 突變株全長cDNA 的改造、病毒復(fù)制子的研究以及減毒滅活疫苗的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞、載體及細(xì)菌 SARS-CoV-2 WIV04株（GenBank 號：MN996528.1）滅活病毒原液由中國科學(xué)院武漢病毒研究所提供；Stellar Competent cell購自日本 TaKaRa 公司；pUC19 載體和 pBR322 載體購自生工生物工程（上海）股份有限公司；pBelo-BAC11 質(zhì)粒（簡稱 pBac）購自 BioVector 質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心；DY380 細(xì)菌由于代冠課題組惠贈。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑盒、質(zhì)粒大提試劑盒和DNA 純化試劑盒購自德國Qiagen 公司；凝膠回收和PCR 清潔試劑盒購自美國Clontech 公司；KpnⅠ、HindⅢ、AscⅠ和 NotⅠ等限制性內(nèi)切酶、CIP 酶、Q5高保真酶和Phusion 高保真聚合酶購自美國NEB 公司；Premix Taq 聚合酶、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 和 In-Fusion HD Cloning System 購自日本TaKaRa 公司；Gibson Assembly Kit 購自美國Thermo Scientific 公司。

1.3 SARS-CoV-2（含 2GC）全長 cDNA 的構(gòu)建

從SARS-CoV-2 滅活病毒原液中提取病毒RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板，首先將SARS-CoV-2 基因組全長分成17 個小片段擴(kuò)增出覆蓋全長的DNA 片段；然后利用In-Fusion 克隆將這些小片段分為6 個5 000 bp 的DNA 片段，分別連接至pUC19 載體，得到相應(yīng)的重組質(zhì)粒；再利用Gibson Assembly kit 將這6 個重組質(zhì)粒分3 次逐步連接至pBR322 載體上，每次連接2 個片段即10 000 bp 長度，連接形成的重組質(zhì)粒經(jīng)SARS-CoV-2 基因組片段右側(cè)的NotⅠ位點酶切線性化，再連接第2 個10 000 bp片段，第3 個10 000 bp 采取的連接方式類似，以此得到全長30 000 bp 的重組質(zhì)粒。由于Gibson Assembly kit 中存在5′-3′核酸外切酶，可消化中間過程中的重組質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切形成的5′overhang，導(dǎo)致在連接第 2 個 10 000 bp 及第 3 個 10 000 bp 時 NotⅠ酶切位點3′端2 個堿基GC 的滯留。采用Recombineering 技術(shù)修復(fù)這兩處多余的堿基GC。為了區(qū)別于野生型SARS-CoV-2，在全長8 791 nt 和12 655 nt處引入了2 個同義突變，分別生成了2 個BglⅠ酶切位點，以此作為遺傳標(biāo)記。SARS-CoV-2 全長cDNA克隆質(zhì)粒的構(gòu)建策略見圖1。

圖1 SARS-CoV-2 全長cDNA 構(gòu)建策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction strategy for full-length cDNA of SARS-CoV-2

1.3.1 SARS-CoV-2 cDNA 的獲取 用RNA 提取試劑盒抽提SARS-CoV-2 滅活病毒原液RNA，通過PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3.2 SARS-CoV-2 全長小片段擴(kuò)增 以1.3.1 項獲得的cDNA 為模板，用Phusion 或Q5 高保真酶擴(kuò)增 SARS-CoV-2 各 片 段（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P 和 Q）。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，50 ～ 72 ℃ 30 s，72 ℃ 20 ～ 30 s ／ kb，共 30 個循環(huán)；72 ℃2 min。利用SnapGene v 5.2.4 軟件設(shè)計各片段擴(kuò)增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 SARS-CoV-2 全長小片段擴(kuò)增引物Tab.1 Primers used for amplification of small fragments of SARS-CoV-2

1.3.3 含5 kb SARS-CoV-2 基因組重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用In-Fusion HD Cloning kit 將1.3.2 項中擴(kuò)增得到的各段 PCR 產(chǎn)物以 A + B + C（F1）、D + E +F+G（F2）、H+（IF3）、J+K+L（F4）、M +N +O（F5）和P + Q（F6）混合的方式，分別連接至經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的 pUC19 載體（約 2 600 bp），反應(yīng)條件為50 ℃孵育15 min。各取5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50 μL Stellar Competent Cell，并涂布于含氨芐青霉素（100 mg ／ mL）的 LB 固體培養(yǎng)基。第 2 天對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR 鑒定，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。6 個含5 000 bp SARS-CoV-2 cDNA 片段的重組質(zhì)粒（約7 600 bp）分別命名為pUC19-F1、pUC19-F2、pUC19-F3、pUC19-F4、pUC19-F5 和pUC19-F6。以重組質(zhì)粒pUC19-F1 為例說明利用In-Fusion 克隆合成6 個含5 000 bp 病毒基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程見圖2（以基因組1-5 012 nt的連接為例）。

圖2 In-Fusion 連接示意圖Fig.2 Schematic diagram of assembly by In-Fusion

1.3.4 含30 kb 目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pUC19-F1 ～pUC19-F6 重組質(zhì)粒作為模板，利用表2 中的引物分別擴(kuò)增 F1 ～ F6。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，50 ～ 72 ℃ 30 s，72 ℃ 20 ～ 30 s ／ kb，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 2 min。先將 F1 和 F2 組合，與經(jīng) PCR 背向擴(kuò)增的pBR322 線性化質(zhì)粒（約3 200 bp）進(jìn)行Gibson Assembly 連接（反應(yīng)體系及程序詳見Gene-ArtTMGibson Assembly?EX Cloning Kits 使用手冊），構(gòu)建得到長度約為13 000 bp 的重組質(zhì)粒，命名為pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975）。其中，線性化的pBR322 載體通過正反向引物分別在5′和3′端引入AscⅠ和NotⅠ酶切位點。對pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975）質(zhì)粒進(jìn)行NotⅠ單酶切和CIP 去磷酸化處理，并切膠純化后，再與F3 和F4 一起混合，進(jìn)行第2 輪Gibson Assembly 連接，得到長度約23 000 bp的重組質(zhì)粒，命名為pBR322-SARS-CoV-2-Ⅱ（1-19 975&1GC）。以相同策略進(jìn)行F5 和F6 與載體的第3輪 Gibson Assembly 連接，得到長度約 33 000 bp 的重組質(zhì)粒，命名為 pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）。以F1 + F2 連接第1 個10 000 bp 為例，利用Gibson Assembly 構(gòu)建重組質(zhì)粒pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975）的過程見圖3。用AscⅠ和NotⅠ對3 個重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

圖3 Gibson Assembly 連接示意圖Fig.3 Schematic diagram of assembly by Gibson Assembly

1.4 質(zhì)粒 pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）的修復(fù)

質(zhì)粒構(gòu)建過程中產(chǎn)生的2 處多余GC 堿基（9 975 nt 和19 975 nt）的修復(fù)可利用Recombineering技術(shù)完成，而Recombineering 必需依賴單拷貝質(zhì)粒，因此選擇pBac 質(zhì)粒來刪除這兩處GC 堿基。

1.4.1 pBacm-SARS-CoV-2-FL（2GC）的構(gòu)建 設(shè)計分別與SARS-CoV-2 全長基因組3′端和 5′端同源50 bp 的正反向引物，并通過引物分別引入NotⅠ及AscⅠ酶切位點，以pBac 質(zhì)粒為模板，背向擴(kuò)增其載體骨架（約6 300 bp），簡稱為pBacm。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30 個循環(huán)；72 ℃ 2 min。再將 pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）質(zhì)粒進(jìn)行AscⅠ和NotⅠ酶切，通過酚氯仿抽提及異丙醇沉淀的方式純化酶切后的載體。利用Gibson Assembly Kit 將該酶切回收后載體與經(jīng)PCR擴(kuò)增線性化的pBacm 質(zhì)粒進(jìn)行連接。在兩個連接處分別設(shè)計進(jìn)行菌落PCR 鑒定的引物。構(gòu)建的新重組質(zhì)粒命名為 pBacm-SARS-CoV-2-FL（2GC），通過電擊轉(zhuǎn)化至DY380 溫度敏感型感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個菌落，30 ℃過夜培養(yǎng)。

1.4.2 兩處GC 堿基的刪除

采用兩步篩選法進(jìn)行Recombineering，即先用含有正、負(fù)篩選標(biāo)記的SacB + Kan 片段替換待修復(fù)區(qū)域，再用正確的病毒基因組序列替換SacB + Kan片段。由于9 975 nt 和19 975 nt 兩處均存在多余的GC 堿基，需先修復(fù)第1 處序列，再在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行第2 處序列的修復(fù)，因此共需經(jīng)歷4 輪Recombineering。

1.4.2.1 正、負(fù)篩選標(biāo)記SacB + Kan 的插入 設(shè)計帶有50 bp 與SARS-CoV-2 基因組同源的引物（引物序列見表3），PCR 擴(kuò)增SacB + Kan 片段并進(jìn)行純化。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 2 min。在同源臂以外區(qū)域設(shè)計菌落PCR 鑒定引物。Recombineering技術(shù)操作如下：取200 μL 含pBacm-SARS-CoV-2-FL（2GC）質(zhì)粒的DY380 菌液，轉(zhuǎn)接至新鮮的11 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)。待菌液A600= 0.6 ～0.9時，將其在42 ℃誘導(dǎo)15 min，迅速置于冰上10 min。將菌液離心后棄去LB 液體，以無菌水洗滌兩次后，制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。向感受態(tài)細(xì)胞中加入清潔回收的SacB + Kan PCR 產(chǎn)物（約500 ng）進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。取100 μL 轉(zhuǎn)化菌液，涂布于含卡那霉素（30 mg ／mL）的 LB 固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置過夜培養(yǎng)。第2 天進(jìn)行菌落PCR 鑒定，選取正確插入SacB+Kan的陽性轉(zhuǎn)化子，記為pBacm-SARS-CoV-2-（SacB+Kan）-9 975 ／ 19 975，30 ℃搖床過夜培養(yǎng)。

1.4.2.2 正確序列的替換 以cDNA 為模板擴(kuò)增橫跨9 975 nt 或19 975 nt 處前后約600 bp 的正確序列（引物序列見表3），并進(jìn)行純化。反應(yīng)條件為：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃2 min。該正確序列位置與上一步插入的（SacB-Kan）-9 975／19 975 位置相同。將正確序列通過Recombineering 技術(shù)電擊轉(zhuǎn)化至含pBacm-SARSCoV-2-（SacB + Kan）-9 975 ／ 19 975 質(zhì)粒的DY380感受態(tài)細(xì)胞中，操作步驟參照1.4.2.1 項。對陽性轉(zhuǎn)化子大量培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。經(jīng)4 輪Recombineering 過程得到的重組質(zhì)粒命名為pBacm-SARS-CoV-2-FL，酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表3 SARS-CoV-2-FL（2GC）修復(fù)擴(kuò)增引物Tab.3 Primers used for modification of SARS-CoV-2-FL（2GC）

2 結(jié) 果

2.1 含5 kb SARS-CoV-2 基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，6 個5 000 bp的病毒基因片段（F1 ～F6）擴(kuò)增產(chǎn)物大小正確，見圖4。

圖4 含5 kb SARS-CoV-2 基因片段的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of PCR products containing 5 kb SARS-CoV-2 gene fragments

2.2 含30 kb 目的基因重組質(zhì)粒的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，重組質(zhì)粒pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975）、pBR322-SARS-CoV-2-Ⅱ（1-19 975&1GC）和 pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）經(jīng) AscⅠ和NotⅠ雙酶切后，分別可見大小約為10 000、20 000和30 000 bp 的病毒基因組cDNA 條帶以及3 000 bp的pBR322 載體條帶，大小均與預(yù)期相符，見圖5。

圖5 重組質(zhì)粒 pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975）、pBR322-SARS-CoV-2-Ⅱ（1-19 975&1GC）、pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）的酶切（AscⅠ／ NotⅠ）鑒定Fig.5 Restriction map of recombinant plasmids pBR322-SARS-CoV-2-Ⅰ（1-9 975），pBR322-SARS-CoV-2-Ⅱ（1-19 975&1GC）and pBR322-SARS-CoV-2-FL（2GC）（AscⅠ／ NotⅠ）

2.3 pBacm-SARS-CoV-2-FL 質(zhì)粒的鑒定 通過Gibson Assembly 連接及Recombineering 修復(fù)，成功獲得了SARS-CoV-2 的全長基因組cDNA 克隆，修復(fù)測序結(jié)果見圖6。重組質(zhì)粒pBacm-SARS-CoV-2-FL（約36 300 bp）經(jīng)AscⅠ和NotⅠ雙酶切，可見約30 000 bp的SARS-CoV-2 全長基因組cDNA 條帶和6 300 bp的pBacm 載體條帶，見圖7，表明成功構(gòu)建了SARSCoV-2 WIV04 株的全長cDNA。

圖6 SARS-CoV-2 全長cDNA 9 975 nt（A）和19 975 nt（B）修復(fù)結(jié)果Fig.6 Modified results of 9 975 nt（A）and 19 975 nt（B）in full-length cDNA of SARS-CoV-2

圖7 重組質(zhì)粒pBacm-SARS-CoV-2-FL 的酶切（AscⅠ／NotⅠ）鑒定Fig.7 Restriction map of recombinant plasmid pBacm-SARSCoV-2-FL（AscⅠ／ NotⅠ）

為驗證遺傳標(biāo)記BglⅠ的正確引入，分別在基因組全長8 791 nt 前后區(qū)域設(shè)計引物擴(kuò)增覆蓋此處BglⅠ的約1 700 bp 的片段和12 655 nt 處約2 000 bp的片段，分別以構(gòu)建好的含全長cDNA 的重組質(zhì)粒pBacm-SARS-CoV-2-FL 和由病毒逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增這兩處片段，并通過BglⅠ酶切鑒定。由cDNA 為模板擴(kuò)增的 PCR 產(chǎn)物（7 945-9 655 和 11 419-13 298）不能被BglⅠ酶切，而以pBacm-SARS-CoV-2-FL 重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增的兩段PCR 產(chǎn)物能被BglⅠ酶切，見圖8，表明本實驗構(gòu)建的pBacm-SARS-CoV-2-FL 重組質(zhì)粒成功引入了兩處BglⅠ位點作為遺傳標(biāo)記，可與野毒株進(jìn)行區(qū)分。

圖8 8 791 nt 和12 655 nt 處BglⅠ酶切位點驗證Fig.8 Validation for BglⅠrestriction sites at 8 791 nt and 12 655 nt

3 討 論

反向遺傳學(xué)作為一項新型的分子生物學(xué)技術(shù)，可在分子水平分析和改造病毒基因組，為RNA 病毒的分子生物學(xué)研究（如病毒的復(fù)制、致病機(jī)理以及防治等）開辟了新途徑［8］。而針對于冠狀病毒的反向遺傳學(xué)技術(shù)在傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）上得到了首次應(yīng)用，TGEV的全長感染性cDNA 克隆是利用BAC 方式生成的［14］，同樣，基于細(xì)菌人工染色體的SARS-CoV、MERSCoV［15］和 SARS-CoV-2 等［11，16］的全長感染性 cDNA也成功構(gòu)建。另一種研究CoVs 的生物學(xué)及致病機(jī)理的替代性反向遺傳學(xué)技術(shù)依賴于以痘病毒為載體進(jìn)行CoV 基因組cDNAs 的克隆和增殖。目前已使用痘病毒載體成功構(gòu)建 HCoV 229E［12］、IBV［17］和MHV-A59［18］的全長冠狀病毒cDNA 等。這種有益的病毒基因組改造技術(shù)已廣泛應(yīng)用于疫苗和其他治療性藥物的研發(fā)、臨床研究及預(yù)防接種。如流感病毒滅活疫苗減毒疫苗株骨架構(gòu)建的新變異毒種、以減毒株為骨架的四價登革病毒疫苗及以動物輪狀病毒為減毒骨架接入人輪狀病毒中和基因的四價、六價輪狀病毒基因重配伍疫苗等。

目前文獻(xiàn)報道的關(guān)于SARS-CoV-2 以及其他冠狀病毒全長cDNA 或復(fù)制子的構(gòu)建大多采用體外酶切連接的方式［10］。這種方式在進(jìn)行大基因組多個cDNA 片段的連接時，常選用的是ⅡS 類型限制性內(nèi)切酶（如 Esp31、SapⅠ、BsaⅠ和 BsmⅠ等），使用這些酶切位點可實現(xiàn)在體外連接兩個連續(xù)的cDNA 片段。組裝的全長cDNA 在5′末端包含1 個T7 RNA聚合酶啟動子，在3′末端包含1 個poly（A）尾巴和T7 終止子序列，在體外轉(zhuǎn)錄以生成加帽的全長轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本與同時加帽的N 基因轉(zhuǎn)錄本一起轉(zhuǎn)染易感細(xì)胞后，拯救得到感染性病毒。體外cDNA組裝方法簡單直接，且允許使用常規(guī)技術(shù)，并可快速進(jìn)行獨立的cDNA 片段突變，同時可與BAC 載體或痘病毒載體互相結(jié)合［11-12］。

本研究采用了與傳統(tǒng)酶切連接方式不同的方法，基于無縫克隆及細(xì)菌體內(nèi)同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了SARS-CoV-2 的全長cDNA。在此構(gòu)建過程中融合了 In-Fusion、Gibson Assembly 和Recombineering 3 種技術(shù)。

Recombineering 技術(shù)的原理是利用一個溫度敏感型菌株DY380 進(jìn)行DNA 片段的同源重組，該菌株在42 ℃誘導(dǎo)時會表達(dá)與同源重組相關(guān)的3 個重組酶，而在32 ℃時相關(guān)基因受到抑制作用不能表達(dá)。值得注意的是，Recombineering 僅適用于單拷貝質(zhì)粒（如BAC 載體）。為了提高陽性克隆的篩選效率，本研究創(chuàng)新性地設(shè)計兩步篩選法來進(jìn)行修復(fù)：①通過同源重組方式將正、負(fù)篩選標(biāo)記（Kan + SacB）插入待修復(fù)區(qū)域，利用Kan 抗性基因篩選正確的重組質(zhì)粒；②在相同位置通過同源重組方式將正確序列替換正 ／ 反向標(biāo)記，利用Chl 抗性基因和SacB 基因篩選含有正確序列的重組質(zhì)粒，后者具有蔗糖致死效應(yīng)。

本研究論述的方法為冠狀病毒等大基因組的全長感染性cDNA 克隆的構(gòu)建提供了全新的思路。此外，構(gòu)建的SARS-CoV-2 全長cDNA 是連接于pBacm單拷貝質(zhì)粒上，與BAC 載體相兼容，方便提取、保存以及進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)實驗操作。同樣，利用Recombineering 技術(shù)使得對SARS-CoV-2 全長cDNA進(jìn)行點突變或部分基因片段的缺失、替換等變得簡易可行。這種方法不需要像傳統(tǒng)酶切連接方法一樣，必須從最初的含有突變或缺失、替換的cDNA 片段擴(kuò)增步驟開始，再進(jìn)行后續(xù)的酶切與連接。本研究提供的全長cDNA 構(gòu)建思路也可應(yīng)用于其他小基因組RNA 病毒，如腸道病毒、麻疹病毒等病毒的cDNA 構(gòu)建。

由于SARS-CoV-2 的高危性，關(guān)于其全長cDNA的感染性驗證和病毒拯救必須獲得國家生物安全主管部門批準(zhǔn)后，在法規(guī)嚴(yán)格監(jiān)管下，在生物安全等級 3 級（biosafety laboratory-3，BSL-3）以上的實驗室進(jìn)行。但質(zhì)粒構(gòu)建及cDNA 上的改造修飾等前期工作可在生物安全等級2 級實驗室進(jìn)行，如利用Recombineering 技術(shù)進(jìn)行SARS-CoV-2 減毒株、復(fù)制缺陷株以及復(fù)制子的構(gòu)建［19-22］。SARS-CoV-2 減毒株可作為候選滅活疫苗的疫苗株，減輕新冠滅活疫苗生產(chǎn)過程中所面臨的生物安全風(fēng)險及對周邊環(huán)境的潛在威脅。SARS-CoV-2 復(fù)制子可作為高通量的篩選工具，用于抗病毒藥物或治療性抗體的篩選研究［21-23］，由于復(fù)制子只保留了與復(fù)制相關(guān)的基因而去除了與病毒毒力相關(guān)基因如E、S、M 等，使得抗病毒藥物的篩選可在生物安全等級2 級實驗室進(jìn)行［23］，保障了科研人員的安全。同時，敲除或改造SARS-CoV-2 復(fù)制子中某個或多個非結(jié)構(gòu)蛋白如nsp1、nsp14、nsp15 等，可用于研究病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的功能及病毒RNA 分子的合成機(jī)制［24］。另外，針對目前出現(xiàn)的多種SARS-CoV-2 變異株及免疫逃逸株，可對構(gòu)建的全長cDNA 進(jìn)行相應(yīng)位點的突變即可實現(xiàn)變異株的cDNA 構(gòu)建［25］，研發(fā)基于減毒株并針對免疫逃逸株的新一代滅活疫苗。

為了更加深入地研究病毒基因結(jié)構(gòu)與功能，SARS-CoV-2 全長cDNA 作為一個重要的工具，對基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究必不可少。本研究的構(gòu)建方法為大基因組RNA 病毒全長cDNA 的構(gòu)建提供了全新的思路，也為其他RNA 病毒全長cDNA 的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。