張海濤 祁蘇嫻 董曼佳 陸廷瑾 楊婷婷

(江蘇省蘇微微生物研究有限公司，無錫 214063)

近年來，我國重金屬污染糧食的事件頻發(fā)，引起了全社會的廣泛關(guān)注。水稻是我國第一大糧食作物，全國約65%人口以稻谷為主食，因此，稻谷的安全品質(zhì)與人類健康密切相關(guān)，長期食用被鎘污染的糧食，造成人體內(nèi)重金屬鎘的富集，對體內(nèi)的臟器造成負(fù)擔(dān)，特別是腎臟、肝臟等的病變，還會導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的損害[1]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762—2017中關(guān)于稻谷中鎘的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.2 mg/kg。但是稻谷中鎘超標(biāo)的現(xiàn)象時有發(fā)生，因此研究稻谷中鎘的檢測方法意義重大。目前，重金屬鎘的常規(guī)檢測方法[4]主要包括：原子吸收光譜法(AAS)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)等[1-4]，這些方法測定準(zhǔn)確，精密度高，但設(shè)備昂貴，前處理繁瑣耗時，試樣需進行消解，對人員素質(zhì)要求較高，不能滿足基層檢測單位快速檢測的要求。所以迫切需要建立一種快速、方便、準(zhǔn)確和低成本的可實現(xiàn)批量樣本快速篩查的檢測方法，從而滿足糧食收購過程監(jiān)控、現(xiàn)場監(jiān)督、檢查的工作需要。免疫分析法與上述幾種分析方法相比具有操作簡便、特異性好、分析檢測成本低廉的優(yōu)點，目前已報道的免疫分析方法大多膠體金試紙條或者ELISA法[5,6]，而且多用于環(huán)境樣本中重金屬的檢測，而采用時間分辨免疫熒光層析法檢測糧食中的重金屬鮮有報道。本研究在前期真菌毒素時間分辨免疫熒光層析卡的研發(fā)基礎(chǔ)上[7，8]，開發(fā)了重金屬鎘的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，可用于稻谷中重金屬鎘的快速定量檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

SW-2時間分辨熒光檢測儀，GL-21M高速冷凍離心機，HS-3垂直混勻儀(超聲機JP-100T，BPG-9240A精密鼓風(fēng)干燥箱，HM3035三維劃膜噴金儀，CTS300數(shù)控裁條機，ZQ2000自動斬切機。

1.2 試劑與材料

碳二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)；乙二胺四乙酸(EDTA)；Cd-EDTA-BSA偶聯(lián)物、抗Cd-EDTA單抗；羊抗鼠IgG；銪Eu3+納米微球；硝酸纖維素膜；樣品墊；吸水紙；PVC底板；重金屬鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000μg/mL)、有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(糙米粉)；其他糙米樣品(通過ICP-MS定值)。

1.3 實驗方法

1.3.1 抗Cd-EDTA單抗的熒光納米微球標(biāo)記

將銪Eu3+納米微球超聲分散10 min后，取出100 μL于2 mL 圓底離心管中，加入900 μL超純水混勻，并超聲分散5 min。分別配制50 mg/mL NHS與EDC的乙醇溶液，各取50 μL加入混合液中，混勻后于垂直混勻儀上室溫旋轉(zhuǎn)混勻40 min，15 000r/min離心30 min，去除上清液，加入1 mL超純水，超聲5 min使微球分散。于活化后的微球懸液中加入0.2 mg抗Cd-EDTA單抗，置于垂直混勻儀上室溫反應(yīng)2 h，加入BSA使之最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，封閉1 h，15 000 r/min離心30 min，去除上清液，加入1 mL復(fù)溶液超聲分散后2～8 ℃冷藏備用。

1.3.2 熒光免疫試紙條的組裝

通過實驗條件篩選，確定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作濃度以及熒光抗體的工作濃度。用三維劃膜噴金儀將包被抗原和羊抗鼠IgG分別包被于NC膜上，形成檢測線(T)和質(zhì)控線(C)。將一定濃度的熒光標(biāo)記抗體噴涂于結(jié)合墊上，上述NC膜和結(jié)合墊于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h以上。以PVC膠粘板作襯板，將層析膜粘貼在襯板的中央。將樣品墊、結(jié)合墊、吸水紙分別粘貼在層析膜的兩端，并且兩墊之間有1～2 mm的交聯(lián)。將組裝好的試紙條大板用自動斬切機切割成寬4 mm、長60 mm的板條，裝于塑料卡殼中，用壓殼機壓緊。放入帶干燥劑的鋁箔袋中，連續(xù)封口機封口后，常溫保存。

1.3.3 檢測原理

重金屬Cd時間分辨熒光免疫層析定量檢測卡應(yīng)用競爭抑制免疫層析的原理，樣本中若含有重金屬Cd，會先與樣品稀釋液中的EDTA形成螯合物(即Cd-EDTA)，在側(cè)向移動的過程中會與熒光微球標(biāo)記的特異性單克隆抗體反應(yīng)，從而抑制抗體和NC膜檢測線(T)上的抗原(Cd-EDTA-BSA偶聯(lián)物)的結(jié)合。隨著樣本中Cd含量的升高，結(jié)合于檢測線上的抗體量減少，相應(yīng)的檢測線熒光強度也隨之變?nèi)?。使用專用時間分辨熒光免疫層析檢測儀讀數(shù)，可定量的測出樣本中Cd的含量。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

配制0.01 mol/L的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液，加入0.5%的吐溫-20和1 mg/L的EDTA，以此作為樣品稀釋液，將Cd標(biāo)準(zhǔn)品1 000 μg/mL 用上述樣品稀釋液定容配制成1 000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液；再逐步稀釋成濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取100 μL加至試紙條的樣品孔中，室溫(25±5)℃下反應(yīng)10 min，由低濃度到高濃度進行檢測，采用時間分辨熒光儀檢測T線與C線熒光強度，計算T/C值。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對數(shù)值(lnC)為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T0/C0值的比值所得百分比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱1.0 g粉碎均勻樣本至15 mL離心管中，量取5 mL 1 mol/L的稀硝酸溶液，至漩渦混勻器上渦旋提取3min，于離心機中4 000 r/min離心5 min，得上清液。移取500 μL上清液于1.5 mL離心管中，加入20 μL 5 mol/L 的NaOH溶液，至漩渦混勻器上渦旋混勻，吸取50 μL上述混勻液于1.5 mL離心管中，再加入950 μL樣品稀釋液至其中，至漩渦混勻器上渦旋混勻，1 min內(nèi)待檢。

1.3.6 方法的技術(shù)參數(shù)1.3.6.1 靈敏度

1.3.6.2 檢出限與定量限

1.3.6.3 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度依據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定值的檢測偏差判定，用正確度表示。采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別根據(jù)步驟1.3.5和1.3.4進行處理和檢測，平行測定不低于6次。根據(jù)時間分辨熒光分析儀測得的T/C值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測濃度，按式(1)計算正確度：

正確度=檢測均值/樣本標(biāo)定值×100%

(1)

與儀器法檢測比對:采用制備好的時間分辨熒光免疫層析卡與ICP-MS方法分別對六個濃度梯度的糙米樣品進行雙試驗檢測，采用配對t檢驗法比較兩種方法的檢測結(jié)果是否存在顯著差異性。

1.3.6.4 精密度

精密度依據(jù)批內(nèi)精密度，指同一批次產(chǎn)品檢測同一樣本結(jié)果的重復(fù)性，用變異系數(shù)(CV)表示，根據(jù)式(2)計算。采用三個濃度水平的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具體步驟同1.3.6中準(zhǔn)確度測定的方法。根據(jù)所得測定結(jié)果，計算變異系數(shù)(CV值)。

變異系數(shù)(CV)=標(biāo)準(zhǔn)差/檢測均值×100%

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

建立的重金屬Cd的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.1～5 ng/mL濃度范圍內(nèi)，有效劑量值即抑制率在85.1%～21.8%，線性回歸相關(guān)系數(shù)R2達0.994 6，直線方程y=-0.161 1x+0.497 5。由此，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，并以此作為以下實驗的線性濃度。

2.2 方法的技術(shù)參數(shù)

2.2.1 靈敏度

表1 重金屬Cd靈敏度的測定

2.2.2 檢出限與定量限

表2 重金屬Cd檢出限與定量限的測定

2.2.3 準(zhǔn)確度

采用3個不同含量水平的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按照步驟檢測，測定結(jié)果如表3所示，可見正確度在81.0%～91.7%之間，變異系數(shù)(CV)均在15%以下。糙米中重金屬Cd的測試結(jié)果見表4，層析卡測定的td= 1.02，經(jīng)查t分布表，t0.05,5=2.570 6，td值未超過查表值，說明測定結(jié)果與ICP-MS方法測定結(jié)果之間無顯著性差異。

表3 重金屬Cd正確度的測定(n=6)

表4 糙米樣品重金屬Cd測定準(zhǔn)確性/mg/kg

2.2.4 精密度

采用同一批次層析卡，采用3個濃度水平的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定結(jié)果見表3，通過測定值計算得出的變異系數(shù)在5.1%～7.7%之間，均低于10%，說明精密度良好。

3 結(jié)論

本研究在前期真菌毒素時間分辨免疫熒光層析卡的研發(fā)基礎(chǔ)上，開發(fā)了重金屬鎘的時間分辨免疫熒光層析定量檢測卡，該方法檢測重金屬鎘，樣品前處理簡單、快速，與傳統(tǒng)儀器法測定相比安全系數(shù)較高。對所建立的方法進行了一系列參數(shù)優(yōu)化，該方法的檢出限和定量限分別為0.026 mg/kg和0.064 mg/kg，對有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測回收率在81.0%～91.7%之間，對實際樣本的檢測與ICP-MS檢測結(jié)果一致性較高。

所建立的時間分辨免疫熒光試紙條操作簡單，樣本處理過程只需稀酸簡單提取和稀釋后即可測定，整個操作過程大約需要20 min，配套小型經(jīng)濟、便攜的熒光分析儀，適用于大量樣本的快速初步篩查，從而滿足糧食收購過程監(jiān)控、現(xiàn)場監(jiān)督、檢查的工作需要。