魏 征 楊剴舟 欒 霞 李秀娟 段章群 郭咪咪 楊 茜

(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油加工研究所，北京 100037)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，山茶科、山茶屬的常綠灌木或小喬木[1，2]，種植面積和產(chǎn)量位于我國木本油料之首[3]。油茶籽油源于油茶籽，富含油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸[4]，還含有多酚、生育酚、角鯊烯、植物甾醇和類胡蘿卜素等功能營養(yǎng)伴隨物[5，6]，具有抗癌、抗炎、抑菌、防氧化等保健功效[7-10]。因此，油茶籽油又被稱為“東方橄欖油”，是提供優(yōu)質(zhì)、健康植物油的重要來源。

國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，茶油的保健功效與其含有的天然抗氧化成分多酚密不可分[11，12]。但這些多酚的種類、含量和性質(zhì)，受原料來源、預(yù)處理、加工工藝，提取和測定方法等多種因素的共同影響[13-15]。油脂多酚提取常采用溶劑浸提法，使用甲醇、乙醇和正己烷等溶劑，但傳統(tǒng)萃取有較多缺點(diǎn)，需輔助超聲、微波和負(fù)壓空化法等，提高萃取效率并降低能耗[16，17]。植物多酚常以游離型和結(jié)合型存在，由于檢測條件的限制，目前油脂多酚評價(jià)主要針對總酚含量，多酚鑒定研究也多停留在游離酚層面，降低了其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[18，19]，現(xiàn)有的“極性悖論”及“膠體締合”假說[20]亦未能有效闡明油脂中不同形態(tài)多酚的抗氧化機(jī)制。因此，茶油多酚形態(tài)研究尚處于起步階段，酚類化合物形態(tài)分布的意義亟待揭示。油茶籽油中不同形態(tài)多酚組成不同，有必要基于總酚含量結(jié)合特征酚(如羥基肉桂酸和羥基苯乙酸等)，對油茶籽油中不同形態(tài)多酚提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究和優(yōu)化。

本研究針對冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸為主的游離型特征酚和總酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在完善游離型多酚提取方法，為后期油茶籽油不同形態(tài)多酚提取、鑒定與評價(jià)，油茶籽油適度加工過程多酚保留及調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通油茶籽品種，2018年購于湖南衡陽。乙腈、甲醇、甲酸、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸等，均為色譜純；甲醇、乙醇、正己烷和Na2CO3等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-TOF 6545型超高效液相色譜-四級桿-飛行時(shí)間-質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC Q-TOF MS，搭配UPLC 1290 Infinity II液相系統(tǒng)、Dual AJS離子源和質(zhì)譜自動(dòng)校準(zhǔn)系統(tǒng))，Syenrgy H1MFD型酶標(biāo)儀，F(xiàn)W-135型中草藥粉碎機(jī)，ENG2-A型液壓榨油機(jī)，SI-T236型Vortex-Genie2旋渦混合儀，KQ-300V DV型三頻數(shù)控超聲波清洗器，SHP DC-1015型低溫恒溫槽，Sigma 3-18K型高速冷凍離心機(jī)，BUCHI R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

采購后的油茶籽原料，經(jīng)低溫干燥至含水量5%～7%，4 ℃冷藏暫存。使用時(shí)經(jīng)殼仁分離、粉碎過篩，混合制胚(含殼率15%)，冷榨以獲得初榨油，離心過濾，充氮避光4 ℃保存。

1.3.2 超聲波輔助溶劑法提取油茶籽油游離型多酚

參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[14,21]和Alu′Datt等[22]的方法，略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取1.000 0 g油茶籽油于50 mL離心管中，按料液比1∶1和1∶20(g/mL)加入正己烷和甲醇，分別漩渦30 s，置于超聲波清洗器中(通過玻璃反應(yīng)釜和低溫恒溫槽實(shí)現(xiàn)提取過程動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)控溫)，在30 ℃、270 W、45 kHz下超聲提取30 min，7 600 g離心10 min，分離有機(jī)相，殘油重復(fù)提取2 次。合并3次有機(jī)相，40℃下真空旋蒸，2 mL色譜純甲醇復(fù)溶，-20 ℃保存。樣品先經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾，再上UPLC Q-TOF MS檢測。

1.3.3 油茶籽油游離型多酚提取單因素實(shí)驗(yàn)

對溶劑比例、料液比、超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和提取次數(shù)等進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定各因素影響程度和適宜范圍。單因素實(shí)驗(yàn)參照1.3.2，只變更單因素項(xiàng)，其余不變。其中，甲醇比例選用50%～100%，料液比選用1∶5～1∶30，超聲功率選用150～300 W，提取時(shí)間選用10～60 min，提取溫度選用20～70 ℃，提取次數(shù)選用1～6次。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化油茶籽油游離型多酚提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以游離型反-肉桂酸、4-羥基苯乙酸和總酚含量為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對料液比、超聲功率和提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析。各因素及水平編碼見表1。

表1 油茶籽油游離型多酚提取因素水平表

1.3.5 指標(biāo)測定1.3.5.1 總酚含量測定

參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[14,23]，略作改動(dòng)。取20 μL樣液或各梯度標(biāo)準(zhǔn)液至2 mL離心管，依次加入780 μL蒸餾水、50 mL福林酚試劑和150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的Na2CO3溶液。漩渦30 s，40 ℃水浴30 min，使用酶標(biāo)儀在760 nm波長處測定吸光度。結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示(mg/kg)，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.001 2x+0.000 7(R2=0.999 8)，線性范圍0～500 μg/mL。

1.3.5.2 游離型特征酚含量測定

UPLC Q-TOF MS分析參考實(shí)驗(yàn)室已有方法[14,23-24]，有改動(dòng)。

色譜條件：Agilent UPLC 1290液相系統(tǒng)，Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×100 mm×2.7 μm)；流動(dòng)相A為0.1%甲酸-水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸-乙腈。洗脫梯度：0～2 min，5% B；2～20 min，5%～45% B；20～21 min，45%～95% B；21.1～32 min，柱子沖洗平衡。流速300 μL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：Agilent Q TOF 6545質(zhì)譜系統(tǒng)，ESI負(fù)離子全掃描模式。離子源干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，霧化氣壓力40 psi，鞘氣溫度400 ℃，鞘氣流速12 L/min，毛細(xì)管裂解電壓-3.5 kV，毛細(xì)管出口電壓135 V，碰撞能量(30±5) eV，掃描范圍100～1 000 u。反-肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=62 154.34x+12 712.82(R2=0.999 9)，線性范圍0～5.47 μg/mL；4-羥基苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=51 854.60x+1 264.02(R2=0.999 6)，線性范圍為0～5.52 μg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Microsoft Excel 2016統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，Origin 2020作圖，SPSS 26.0進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan′s，P=0.05)，Design-Expert 12.0進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 甲醇比例對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖1表明，油茶籽油中游離型總酚和特征酚在

注：不同小寫字母代表0.05水平上存在顯著性差異。下同。圖1 甲醇比例對油茶籽油游離型多酚含量的影響

甲醇比例較低時(shí)含量較低，相互間差異不顯著，80%以后快速升高，100%時(shí)達(dá)到最高，如100%甲醇時(shí)的總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別是50%時(shí)的4.11、2.04和1.86倍。表明油茶籽油游離型多酚含量與甲醇濃度顯著正相關(guān)，與魏征等[21]及周晴芬[25]所發(fā)現(xiàn)的丙酮和乙醇等有機(jī)溶劑濃度越高，對多酚的提取效果越好相一致。因此，后續(xù)選擇100%甲醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 料液比對油茶籽油游離型多酚含量的影響

由圖2可知，料液比顯著影響油茶籽油中游離型多酚含量。在料液比1∶5～1∶20范圍內(nèi)，多酚含量均隨著提取溶劑用量增大而增大，隨后顯著下降至最低，如在料液比1∶20時(shí)總酚和反-肉桂酸含量分別達(dá)到110.11 mg/kg和571.48 μg/kg，而在1∶30時(shí)其含量分別僅為前者的67.79%和75.55%。綜合認(rèn)為，選擇料液比1∶20效果最好。

圖2 料液比對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.3 超聲功率對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖3反映了不同超聲功率下油茶籽油中游離型多酚含量變化。當(dāng)超聲功率在150～210 W時(shí)，總酚和反-肉桂酸含量無顯著性差異，在240 W時(shí)有顯著最高值，后又快速下降。而4-羥基苯乙酸含量不受超聲功率的顯著影響，但變化趨勢與總酚相一致，從而選擇240 W進(jìn)行后續(xù)研究。超聲功率對游離型總酚和特征酚含量影響趨勢不同，主要是超聲強(qiáng)度影響介質(zhì)中的空化作用強(qiáng)度，在最合適的超聲功率下，空化作用與機(jī)械作用有最佳結(jié)合點(diǎn)，此時(shí)有效成分溶出最完全，提取率最大[26]，但對不同有效成分影響有一定差異。

圖3 超聲功率對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.4 提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量的影響

提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量有較大影響(圖4)，其總酚和特征酚均在20 ℃提取時(shí)較低，30℃提取時(shí)最高，隨后在30～70 ℃提取時(shí)又顯著下降，只有少量例外。其中，反-肉桂酸的下降趨勢最為明顯，從20 ℃提取時(shí)的600.51 μg/kg下降到70 ℃提取時(shí)的339.20 μg/kg，減少了43.51%，表明30 ℃后，油茶籽油游離型多酚與提取溫度顯著負(fù)相關(guān)，且反-肉桂酸更具有溫度敏感性。

圖4 提取溫度對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.5 提取時(shí)間對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖5表明，油茶籽油中游離型總酚和特征酚含量均在10～30 min內(nèi)隨提取時(shí)間延長逐漸增大，30 min后總酚和4-羥基苯乙酸略有上升，但相互之間無顯著性差異，而反-肉桂酸則顯著下降。一般提取時(shí)間越長多酚含量越高，但大于30 min后特征酚含量反而降低，可能是某些脂溶性成分隨提取時(shí)間延長而溶出[21]，因此后續(xù)選擇30 min繼續(xù)研究。

圖5 提取時(shí)間對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.1.6 提取次數(shù)對油茶籽油游離型多酚含量的影響

圖6表明，油茶籽油中游離型4-羥基苯乙酸和反-肉桂酸分別在提取2和3次時(shí)含量最高，隨后略有下降；而總酚則隨提取次數(shù)增加逐漸增加，但在提取3次后無顯著性差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)與料液比存在交互作用，通常料液比越大，提取效果越好，所需提取次數(shù)越少，與前人研究結(jié)果相似[27，28]。但提取次數(shù)過多會(huì)造成溶劑和能源浪費(fèi)，也給蒸發(fā)、濃縮等后續(xù)處理帶來麻煩，因此選擇3次開展實(shí)驗(yàn)。

圖6 提取次數(shù)對油茶籽油游離型多酚含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行回歸分析(表3)，擬合后得到超聲波輔助溶劑提取油茶籽油中游離型多酚的二次多項(xiàng)回歸方程：Y總酚= 98.84-4.50A-3.35B+2.45C+2.32AB-4.71AC+3.19BC-14.40A2-17.13B2-14.85C2；Y反-肉桂酸=516.62-14.80A-26.02B+9.54C-31.22AB-27.00AC-25.04BC-23.58A2-58.94B2-46.83C2；Y4-羥基苯乙酸=346.81+14.39A-2.10B+14.53C+9.24AB-6.54AC-8.43BC-28.64A2-21.12B2-21.05C2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

考慮到響應(yīng)面模型中反-肉桂酸含量的擬合度不好，此處僅分析各因素交互作用對總酚和4-羥基苯乙酸含量的影響。其中，料液比和提取時(shí)間交互作用對游離型總酚含量影響顯著，但各因素交互作用對游離型4-羥基苯乙酸含量影響不顯著，與方差分析相一致。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)建立的模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到的最佳工藝條件為：料液比1∶19.73(g/mL)、超聲功率265.77 W、提取時(shí)間31.86 min，此時(shí)游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸的含量分別為99.10mg/kg、520.70 μg/kg和348.14 μg/kg。為了便于實(shí)際操作，確定油茶籽油游離型多酚提取條件為：料液比1∶20、超聲功率270 W、提取時(shí)間32 min，進(jìn)行3 組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別為(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg，變化幅度在-2.28%～+5.81%之間，實(shí)際結(jié)果與理論預(yù)測吻合度較高，得到的最佳提取條件可靠且有應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助溶劑提取法，針對冷榨油茶籽油中以反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸為主的游離型特征酚和總酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、超聲功率和提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到的最佳工藝條件為：料液比1∶19.73(g/mL)、超聲功率265.77 W、提取時(shí)間31.86 min。在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其游離型總酚、反-肉桂酸和4-羥基苯乙酸含量分別為(104.86±8.47) mg/kg、(506.21±25.62) μg/kg和(340.18±18.33) μg/kg。所評價(jià)的實(shí)驗(yàn)因素和所優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)準(zhǔn)確可靠，所確定的各因素較優(yōu)水平范圍真實(shí)有效，可用于實(shí)際提取操作。本研究旨在完善油茶籽油游離型多酚提取方法，可為后期油茶籽油結(jié)合型多酚提取與鑒定，油茶籽油適度加工過程多酚保留與調(diào)控提供理論依據(jù)。