李顏桃 仲崇華 張健榮 曲逸文 畢師誠,4,5 馬 躍,4,5 趙嬋娟 曹立亭,4,5

(西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院中獸醫(yī)學(xué)系1，重慶 402460) (四川省資陽市樂至縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局2，資陽 641500) (西南大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院3，重慶 402460) (重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心4，重慶 402460) (西南大學(xué)中獸醫(yī)藥研究所5，重慶 402460) (重慶三峽職業(yè)學(xué)院6，重慶 404155)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)作為藏藥“四大金剛”之首(沙棘、冬蟲夏草、藏紅花、雪蓮)，屬胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)[1]。早在1300年前，唐代《四部醫(yī)典》中就有80余處記載了沙棘，并被尊為“西域圣果”[2]?！吨袊幍洹分袑⑵淞袨檎滟F的藥食兩用品種，兼?zhèn)浣?jīng)濟(jì)價(jià)值與生態(tài)價(jià)值，在中國分布面積大，且種類豐富[3，4]。據(jù)研究報(bào)道，沙棘富含30余種多酚類化合物，主要為黃酮類、原花青素類、酚酸類等活性物質(zhì)，廣泛存在于沙棘果、葉、莖、根等不同器官中[5-9]。Korekar等[10]觀察到酚類物質(zhì)含量與沙棘各部分提取物的抗氧化能力之間存在顯著相關(guān)性，其中樹皮表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化特性，其次是種子、葉子和果肉。相比其他鮮果如黑醋栗(25 mg/100 g)、草莓(20 mg/100 g)和覆盆子(25 mg/100 g)等[11]，沙棘果是酚類化合物的更好來源(260～490 mg/100 g)，具有抗氧化、抗神經(jīng)退行及增強(qiáng)免疫等多種生理功效，可治療肝臟疾病、婦科疾病等[12-17]。

近年來，植物多酚的提取分離技術(shù)及藥理作用已引起研究者廣泛關(guān)注。常用的酚類物質(zhì)提取方法有溶劑萃取法[18]、超聲波輔助提取法[19]、微波輔助提取法[20]、生物酶法[21]等。其中，超聲波提取技術(shù)是通過壓電換能器產(chǎn)生的快速機(jī)械振動波來減少目標(biāo)萃取物與樣品基層之間的作用力，從而實(shí)現(xiàn)固-液萃取分離；其特有的空化效應(yīng)，產(chǎn)生無數(shù)內(nèi)部達(dá)到千個(gè)大氣壓的微氣穴，并不斷“爆破”產(chǎn)生微觀上的強(qiáng)大沖擊波，均勻作用在沙棘籽渣上，沖擊流對細(xì)胞組織產(chǎn)生一種物理剪切力，使之變性、破裂，“轟擊”多酚至逸出，游離于乙醇溶液中[22]，加速了提取過程；同時(shí)超聲提取法具有操作便利、得率較高等優(yōu)點(diǎn)。此外，減壓提取法應(yīng)用于中藥提取，主要是通過抽真空降低了熱敏性活性物隨溫度升高造成的氧化和降解，且使體系更活躍，從而加快提取速率[23]。近年來，植物多酚作為天然產(chǎn)物的提取技術(shù)及其開發(fā)應(yīng)用已成為科研工作人員的研究熱點(diǎn)。然而，以往研究中對沙棘籽多酚的提取方法報(bào)道較少，優(yōu)化多酚提取工藝對深入推進(jìn)沙棘廢棄工業(yè)原料的綜合利用具有重大意義，為沙棘籽后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆沙棘干果，經(jīng)西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院劉娟教授鑒定為胡頹子科沙棘屬新疆沙棘(Hippophaerhamnoides)的干燥果實(shí)。福林酚、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度：HPLC≥98%)，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TAS-98紫外分光光度計(jì)，RE-5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-III循環(huán)水式多用真空泵，DHP-9212型電熱恒溫培養(yǎng)箱，BPS-5200DT超聲波清洗機(jī)，原泰奇氣引式粉碎機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 沙棘干果的預(yù)處理

室溫浸泡洗凈的沙棘干果12 h，人工搗捶分離沙棘果肉與籽，濾出沙棘籽，置60 ℃烘箱烘干，磨碎后用篩網(wǎng)篩出粗粉。采用10倍體積石油醚(沸程60～90 ℃)室溫下浸泡沙棘籽1 h后，70 ℃回流1 h并抽濾，重復(fù)3次，棄去濾渣，自然晾干后得到脫脂沙棘籽粉末[24]。

1.3.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取 25 mg沒食子酸，用70%乙醇溶液定容至25 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。量取1 mL的1.0 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其稀釋后配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，按照福林法測吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，765 nm處的吸光度值為縱坐標(biāo)，重復(fù)3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。

1.3.3 沙棘籽多酚含量的測定

量取待測液 2.0 mL，移入50 mL容量瓶中，加入1.0 mL福林酚試劑，充分混勻后靜置2 min，加入10 mL 7%Na2CO3溶液，充分混合后以蒸餾水定容，置30 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)1 h，每隔15 min振蕩1次。取出后，在波長765 nm處測定吸光度值(以蒸餾水為空白對照)，多酚含量以沒食子酸計(jì)(mg/g)。

式中：C為換算得到的多酚質(zhì)量濃度/mg/mL；V1為樣品總體積/mL；V2為量取樣品測定定容體積/mL；V3為測定用樣品體積/mL；M為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 提取工藝單因素考察

取脫脂沙棘籽粉末1.5 g，預(yù)設(shè)超聲功率210 W、液固比15∶1、超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間30 min為提取工藝中的常規(guī)量。在超聲功率分別為120、165、210、255、300 W，液固比(g/mL)分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，超聲溫度為(30、40、50、60、70 ℃)，超聲時(shí)間為(10、20、30、40、50 min)條件下，由此4個(gè)單因素變量分別替換提取工藝中相應(yīng)的常規(guī)量，耦合真空條件，控制壓強(qiáng)在1.5～2.5 kPa之間，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得多酚樣品。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對多酚含量有顯著差異的因素，確定不同因素及水平值，運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖1可知，沒食子酸在質(zhì)量濃度0～0.25 mg/mL內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)的線性回歸方程為：Y=3.917X+0.064 9，R2=0.996 7。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖2所示，以不同超聲功率為橫坐標(biāo)，多酚得率為縱坐標(biāo)作圖。不同超聲功率對多酚得率有顯著性差異(P< 0.05)?？紤]到超聲功率過高可導(dǎo)致多酚部分降解，故其水平值選取在300 W范圍內(nèi)，結(jié)果表明多酚得率隨提取功率的增加呈升高趨勢，功率為300 W時(shí)得率最高。

以不同液固比為橫坐標(biāo)，多酚得率為縱坐標(biāo)作圖。不同液固比下，沙棘籽多酚得率之間存在顯著性差異(P<0.05)，且隨液固比增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢?？赡苡捎谝毫媳仍?5∶1左右時(shí)溶劑對多酚的溶解已基本達(dá)到飽和，繼續(xù)增加溶劑用量，并不能顯著提高多酚的提取得率。由此可知，最佳提取液固比為15∶1左右。

以不同提取時(shí)間為橫坐標(biāo)，多酚得率為縱坐標(biāo)作圖。沙棘籽經(jīng)不同時(shí)間提取后，多酚得率呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，且多酚得率在提取時(shí)間為30 min時(shí)最高，超過30 min后得率呈下降趨勢。提取時(shí)間過長導(dǎo)致得率下降的原因可能是多酚類物質(zhì)在長時(shí)間提取下發(fā)生氧化變質(zhì)。

不同溫度下，多酚得率之間存在顯著性差異(P<0.05)。溫度低于50 ℃時(shí)，多酚得率隨溫度的升高不斷增加，當(dāng)溫度超過50 ℃后得率呈下降趨勢，提示多酚的適宜提取溫度在50 ℃前后。這與倪玉嬌等[25]在超聲輔助低共熔溶劑提取沙棘籽粕多酚的工藝優(yōu)化中確定的最佳提取溫度45 ℃大致相當(dāng)。高溫可使細(xì)胞壁滲透性增強(qiáng)，增加提取物的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)，降低溶劑的黏度，從而提高得率。但溫度過高時(shí)會引起酚類化合物的降解，產(chǎn)生內(nèi)部的氧化還原及聚合反應(yīng)，致使多酚得率不再上升。

圖2 各提取因素對多酚得率的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取各因素下多酚得率相對更高的水平作為設(shè)計(jì)參照，結(jié)合Box-Behnken中心組合，確定響應(yīng)面分析的因素與水平，采用超聲功率(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)和提取溫度(D)進(jìn)行4因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體試驗(yàn)因素與水平值見表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因子與水平

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 模型的建立與方差分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到沙棘籽多酚得率對超聲功率、液固比、提取時(shí)間和提取溫度的二次多項(xiàng)回歸模型為：

得率=11.10+0.27A+0.91B+0.51C+0.48D-0.38AB-0.19AC+0.66AD-0.27BC+1.33BD+0.14CD-1.61A2-1.08B2-2.76C2-2.37D2

對模型進(jìn)行方差分析，由表3可知，模型的F值為115.25，P<0.01，說明該模型有意義。失擬項(xiàng)F值為0.67，P=0.721 7不顯著，說明模型擬合良好。由表4可知多元相關(guān)系數(shù)R2=0.991 4，表明模型擬系數(shù)的相關(guān)性較好。信噪比為32.794，大于4，表明有足夠信號強(qiáng)度。在該回歸模型下A、B、C、D、AB、AD、BD、A2、B2、C2、D2對多酚得率影響顯著。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表

表4 回歸模型的方差分析

2.3.3 響應(yīng)面分析

以沙棘籽多酚得率為響應(yīng)值，固定1個(gè)因素于中心水平，分析另外2個(gè)因素及其交互作用對多酚得率的影響。液固比和超聲功率對多酚得率的交互作用極顯著(P<0.01)。當(dāng)液固比一定時(shí)，隨著超聲功率的增大，多酚得率增大，超聲功率繼續(xù)增大，多酚得率有下降趨勢；當(dāng)超聲功率一定時(shí)，隨液固比的增大，多酚得率先增大后減小。提取時(shí)間和超聲功率存在交互作用，當(dāng)超聲功率一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，多酚得率先增大，但時(shí)間超過一定值時(shí)，多酚得率呈下降趨勢。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨液固比的增大，多酚得率先增大后減??；提取溫度和超聲功率對多酚得率存在交互作用。當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨超聲功率的增大，多酚得率呈下降趨勢。當(dāng)超聲功率一定時(shí)，多酚得率隨溫度的升高而增大，其等高線為橢圓形可表明提取溫度和超聲功率交互作用極顯著。提取時(shí)間和液固比對多酚得率的交互作用。液固比一定時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，多酚得率先增大后趨于平緩。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨液固比的增大，多酚得率呈先增大后減小的趨勢。超聲溫度和液固比對多酚得率的交互作用極顯著。液固比一定時(shí)，隨著提取溫度的升高，多酚得率逐漸升高，后趨于平緩，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨液固比的增大，多酚得率先增大后降低。提取溫度和提取時(shí)間對多酚得率的交互作用不明顯。在低功率范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間延長，多酚得率增大，當(dāng)功率超過一定值時(shí)，得率減小。當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨溫度的升高，多酚得率不斷增大，最終趨于平緩。

2.3.4 最佳提取工藝的確定與驗(yàn)證

根據(jù)回歸方程分析可知，沙棘籽多酚最大得率對應(yīng)的提取條件為超聲功率260.65 W，液固比17.07∶1，超聲時(shí)間30.33 min，提取溫度52.76 ℃。在此條件下多酚得率的理論值為11.422%。為驗(yàn)證模型是否可靠，從方便可行角度考慮，選取超聲功率260 W，液固比 20∶1，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度52 ℃為沙棘籽粉末最佳提取工藝。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下多酚得率為(11.394±0.083)%，與模型理論預(yù)測值(11.422%)無顯著差異(P>0.05)。

3 結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)對沙棘籽多酚超聲耦合真空提取的超聲功率、液固比、超聲時(shí)間、超聲溫度進(jìn)行考察，并結(jié)合四因素三水平的響應(yīng)面分析法對沙棘籽粉末提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件：超聲功率260 W，液固比 20∶∶1，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度52 ℃。在此工藝條件下沙棘籽多酚得率達(dá)到(11.394±0.083)%。本條件節(jié)能省時(shí)，操作方便，為沙棘籽多酚大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。