王志娟 張 煒 甘文梅 乜世成 高 紅 宋 林

(青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，西寧 810008)

葫蘆巴(Trigonellafoenum-graeeum, L.)，又名大葉蕓香草、香苜蓿，是一種生存力極強的一年生草本植物，系豆科植物蝶形花亞科[1]，它起源于南歐、西亞和地中海地區(qū)，自古以來被用作香料及調(diào)味劑[2]。葫蘆巴種子具有祛寒除濕、溫腎補陽、抗腫瘤、降血糖等多種藥用價值，已被多版《中國藥典》收錄[3]。隨著葫蘆巴膠和葫蘆巴薯蕷皂素資源的開發(fā)，葫蘆巴被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[4]。

葫蘆巴種子中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分，其中，薯蕷皂苷為主要化學(xué)成分[5]，具有舒筋活血、消食利水、脫敏、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等作用[6]。因薯蕷皂苷提取液中雜質(zhì)較多，產(chǎn)品純度低，需經(jīng)純化才能對其進行后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)。皂苷是一種優(yōu)良的天然非離子型表面活性成分，具有親水性的糖體和疏水性的皂苷元，因此具有良好的起泡性，泡沫分離法(foam separation)作為一種基于溶液中溶質(zhì)組分間表面活性的差異進行分離的新型技術(shù)，因具有設(shè)備簡單和適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，已被成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、皂苷及中藥有效成分的分離富集[7,8]。

本實驗以利用超高壓提取技術(shù)提取出的薯蕷皂苷溶液為原料，富集比和回收率作為評價指標(biāo)，通過單因素實驗及Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定出最佳條件，并對其體外抗氧化活性進行研究，為葫蘆巴中薯蕷皂苷的藥理活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葫蘆巴種子：西寧市九康藥材市場 (經(jīng)青海省食品藥品檢定所鑒定)；薯蕷皂苷標(biāo)準品、無水乙醇(AR)、香草醛(AR)、高氯酸(AR)、冰醋酸(AR)。

GX-04多功能粉碎機，101A-1E 電熱鼓風(fēng)干燥箱，BSA224S-CW 電子天平，TU-1901 雙光束紫外-可見分光光度計，IKA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，實驗室自制泡沫分離裝置如圖1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 葫蘆巴中薯蕷皂苷泡沫分離的評價指標(biāo)

采用香草醛-高氯酸顯色法[9]對葫蘆巴中薯蕷皂苷的濃度進行測定，分別按式(1)、式(2)計算葫蘆巴中薯蕷皂苷的的回收率和富集比。

(1)

圖1 泡沫分離裝置圖

(2)

式中：ρf、ρs為泡沫層、殘留層中薯蕷皂苷的質(zhì)量濃度/μg/mL，V0、Vs、Vf為原液、殘留層、泡沫層的體積/mL。

1.2.3 泡沫分離葫蘆巴中薯蕷皂苷單因素實驗

1.2.3.1 上樣濃度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，氣速為500 mL/min，溫度為30 ℃條件下進行泡沫分離操作，考察上樣質(zhì)量濃度在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL時對泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.2 溫度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，氣速為500 mL/min，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進行泡沫分離操作，考察溫度在25、30、35、40、45 ℃時對泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.3 氣速對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在裝液量為350 mL，溫度為30 ℃，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進行泡沫分離操作，考察溫度在350、400、450、500、550 mL/min時對泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.3.4 裝液量對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

在氣速為500 mL/min，溫度為30 ℃，上樣質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL條件下進行泡沫分離操作，考察裝液量在350、350、350、350、350 mL時對泡沫分離薯蕷皂苷的影響。

1.2.4 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計了以保壓時間(A)、保壓壓力(B)、乙醇體積分數(shù)(C)、固液比(D)為因素，薯蕷皂苷的回收率和富集比為指標(biāo)，采用響應(yīng)面Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計優(yōu)化方案，因素水平設(shè)計表見表1。

表1 因素水平設(shè)計表

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

參考王雅等[10]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取0.025 mg/mL DPPH 溶液2.5 mL與2.5 mL無水乙醇混合，測定溶液在 517 nm的吸光值(A0)；精確吸取上述不同質(zhì)量濃度的待測液 2.5 mL與質(zhì)量濃度0.025 mg/mL的 DPPH 溶液2.5 mL 混合，搖勻后放置30 min，測定上述溶液在最大吸收峰處吸光值(Ai)；精確吸取上述不同質(zhì)量濃度的待測液2.5 mL，分別與2.5 mL 無水乙醇混合均勻后，測定各溶液在最大吸收峰波長處的吸光值(Aj)。按式(3)計算清除率。

(3)

1.2.5.2 羥自由基清除能力的測定

參考盧彬等[11]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取待測液2 mL，然后精確加入2 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)，2 mL 硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)，2 mL H2O2溶液(8.8 mmol/L)，混勻后在37 ℃下避光反應(yīng)30 min，510 nm處測其吸光值(Ai)。同時將對照將2 mL H2O2溶液換成2 mL蒸餾水，測其吸光值(Aj)；空白組將2 mL樣品溶液換成2 mL蒸餾水，測其吸光值(A0)。按式(4)計算清除率。

(4)

1.2.5.3 超氧陰離子清除能力的測定

參考盧彬等[12]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取待測液1 mL，依次加入50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.2) 緩沖溶液4.5 mL，充分混勻之后在37 ℃的水浴中10 min后，移取0.4 mL鄰苯三酚溶液并搖勻，當(dāng)反應(yīng)達到4 min后用1.0 mL濃鹽酸終止反應(yīng)(A1)?？瞻捉M將1 mL待測液換成1 mL蒸餾水，測其吸光值(A0)。按式(5)計算清除率。

(5)

1.2.5.4總還原能力的測定

參考歐陽凱等[13]的方法，將未純化的提取液、純化的提取液、VC分別稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL溶液備用。取 1 mL待測液，依次加入pH 6.6，0.2 mol/L 的磷酸緩沖液 2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液 2.5 mL，混勻，50 ℃ 水浴 20 min，加入 10%三氯乙酸溶液2.5 mL，取2.5 mL 上清液，加入蒸餾水2.5 mL，10%三氯化鐵溶液，700 nm 測定吸光度，以吸光值的大小來表示樣品還原能力的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 上樣濃度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

上樣濃度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖2所示，富集比隨濃度的增大而逐漸降低，而回收率隨濃度的增大而逐漸升高。當(dāng)溶液濃度較低時，泡沫穩(wěn)定性較差，溶液黏度較小，泡沫持液率較低[14,15]，因此呈現(xiàn)富集比高而回收率低的現(xiàn)象。隨著溶液濃度的不斷增大泡沫穩(wěn)定性逐漸提高，同時溶液的黏度不斷增大，泡沫夾帶率變高，液體不易回流[16]，因此回收率逐漸升高。

圖2 濃度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.2 溫度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

溫度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖3所示，富集比隨溫度的升高先增大后減小，回收率不斷減小。當(dāng)溫度較低時，溶液黏度及泡沫穩(wěn)定性高，泡沫具有較高持液率，因此回收率較高[17]。當(dāng)溫度較高時，泡沫持液率降低，泡沫層夾帶的薯蕷皂苷含量降低，因此回收率降低[18]。

圖3 溫度對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.3 氣速對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

氣速對泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖4所示，隨著氣速的增加，富集比不斷降低，回收率先升高后降低。當(dāng)氣速較低時，泡沫在分離柱中停留的時間較長，氣泡并聚、排液較充分，可攜帶出的薯蕷皂苷較少，因此富集比高，回收率低。當(dāng)氣速增大時，泡沫的生成速度及上升速度加快，持液率較高，因此，回收率升高[19]。

圖4 氣速對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

圖5 裝液量對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

2.1.4 裝液量對泡沫分離薯蕷皂苷的影響

裝液量對泡沫分離薯蕷皂苷的影響如圖5所示，當(dāng)裝液量較少時，泡沫在分離柱中停留的時間較長，泡沫中攜帶的薯蕷皂苷較大程度上回流至原液中，因此，富集比升高。而當(dāng)裝液量增加時，泡沫的持液率較高，泡沫中的夾帶液在回流前被鼓出來，因此，回收率升高[20]。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計和結(jié)果

選取濃度(A)、溫度(B)、氣速(C)、裝液量(D)進行四因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面實驗設(shè)計，響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 回歸模型的建立與檢驗

對表2進行多元線性回歸擬合后，得到回歸方程并對此方程進行方差分析，方差分析結(jié)果，富集比的線性回歸表見表3和表回收率的線性回歸表見4。富集比(E)=+1.85-0.83A+ 0.15B-0.52C-0.21D-0.040AB+0.32AC+0.21AD-0.017BC+0.070BD+0.080CD-1.083E-003A2-0.050B2+0.23C2+0.50D2；回收率(R)=+89.13+2.69A+1.96B+0.87C+1.19D-0.54AB-3.02AC-4.24AD+ 2.62BC-6.70BD-5.33CD-1.50A2-6.80B2-1.89C2-3.11D2。

表3 富集比的線性回歸表

表4 回收率的線性回歸表

2.2.3 響應(yīng)曲面分析及最佳工藝條件的確定

利用Design-Experter 8.0.6軟件對葫蘆巴中薯蕷皂苷的純化工藝條件進行優(yōu)化，得到最佳純化工藝參數(shù)為：上樣濃度0.03 mg/mL，溫度28.36 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL，在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為88.31%，富集比為3.65。為驗證預(yù)測模型的可靠性，從實際情況出發(fā)，將最佳工藝條件進行調(diào)整：上樣質(zhì)量濃度0.03 mg/mL，溫度28 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL。在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為86.57%，富集比為3.82，接近其預(yù)測值，說明由Design-Expert 8.0.6設(shè)計軟件得到的最佳工藝條件可行。

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 薯蕷皂苷對DPPH自由基的清除能力

圖6 薯蕷皂苷對DPPH自由基的清除能力

薯蕷皂苷對DPPH自由基的清除能力如圖6所示，未純化的薯蕷皂苷、純化后的薯蕷皂苷、VC對DPPH自由基的清除能力隨而增強，與李霄等[21]的結(jié)論一致。在0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，VC對DPPH自由基的清除率最高，但當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達0.05 mg/mL時，純化后的薯蕷皂苷對DPPH自由基的清除效果與VC相接近。

2.3.2 薯蕷皂苷對羥自由基的清除能力

薯蕷皂苷對羥自由基的清除能力如圖7所示，在0.02～0.04 mg/mL范圍內(nèi)，未純化的薯蕷皂苷與純化后的薯蕷皂苷對羥自由基的清除效果相接近，與VC相比略低。

圖7 薯蕷皂苷對羥自由基的清除能力

2.3.3 薯蕷皂苷對超氧陰離子的清除能力

薯蕷皂苷對超氧陰離子的清除能力如圖8所示，薯蕷皂苷對超氧陰離子的清除能力隨濃度的增大而增加，這與王占一等[22]的研究結(jié)果一致。但在所測濃度范圍內(nèi)，VC對超氧陰離子的清除效果明顯高于薯蕷皂苷。

圖8 薯蕷皂苷對超氧陰離子的清除能力

圖9 薯蕷皂苷的總還原能力

2.3.4 薯蕷皂苷的總還原能力

薯蕷皂苷的總還原能力如圖9所示，在較低濃度時，純化后的薯蕷皂苷與VC的總還原能力極其吻合。吸光度值越大，表明總還原能力越強，薯蕷皂苷的總還原能力隨濃度的增大而增加，這與鄒小靈等[23]的研究結(jié)果一致。當(dāng)純化后的薯蕷皂苷質(zhì)量濃度達到0.04 mg/mL，總還原能力趨于平緩，低于VC但高于未純化的薯蕷皂苷。

薯蕷皂苷的總還原能力如圖10所示，在較低濃度時，純化后的薯蕷皂苷與VC的總還原能力極其吻合。吸光度值越大，表明總還原能力越強，薯蕷皂苷的總還原能力隨濃度的增大而增加，這與鄒小靈等[23]的研究結(jié)果一致。當(dāng)純化后的薯蕷皂苷濃度達到0.04 mg/mL，總還原能力趨于平緩，低于VC但高于未純化的薯蕷皂苷。

3 結(jié)論

本實驗以葫蘆巴中薯蕷皂苷為研究對象，采用響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化泡沫分離法純化葫蘆巴中薯蕷皂苷的工藝條件，得出最佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度0.03 mg/mL，溫度28 ℃，氣速450 mL/min，裝液量400 mL，在此條件下，薯蕷皂苷的回收率為86.57%，富集比為3.82。其體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，經(jīng)純化后的薯蕷皂苷對DPPH·、·OH、超氧陰離子有較好的清除效果，具有較強的還原能力，且體外抗氧化活性與皂苷質(zhì)量濃度相關(guān)性顯著。