羅 倩，詹雪冰，董芳媛，孫恩濤，王書(shū)翰，陳 冰

(1.皖南醫(yī)學(xué)院病理教研室，安徽 蕪湖 241002; 2.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院)

胃癌(Gastric cancer, GC)是全球第五大最常見(jiàn)惡性腫瘤，其致死率在所有腫瘤中排名第三[1]。手術(shù)是胃癌患者的主要治療手段，在過(guò)去的幾年里診斷和治療有所進(jìn)步，但由于大部分患者發(fā)病初期無(wú)明顯癥狀，就診時(shí)已進(jìn)入中晚期，并且超過(guò)半數(shù)的胃癌根治術(shù)術(shù)后會(huì)有復(fù)發(fā)或伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，胃癌患者總體5年生存率低于30%[2]。因此，分子標(biāo)記物異常表達(dá)的檢測(cè)可能為胃癌患者早期診斷和預(yù)后的判斷提供有效的參考。

細(xì)胞分裂周期相關(guān)蛋白(cell division cycle-associated，CDCA)家族有8個(gè)成員，即CDCA1(NUF2)、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6(CBX2)、CDCA7、CDCA8。CDCAs基因在生命過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，細(xì)胞分裂過(guò)程中的失調(diào)可能導(dǎo)致惡性腫瘤[3]。據(jù)報(bào)道，CDCA1的缺失抑制了CD103的抗腫瘤活性，降低了黑色素瘤的檢查點(diǎn)反應(yīng)，促進(jìn)了黑色素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[4]。CDCA2通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT通路，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖[5]。CDCA3作為miR-145-5的靶基因，參與調(diào)控結(jié)直腸癌的增殖、轉(zhuǎn)移和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]。CDCA4是Nrf2信號(hào)通路的下游基因，在MCF-7/ADM人乳腺癌細(xì)胞系中調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[7]。CDCA5通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和PI3k/AKT/mTOR通路激活，在膀胱癌中發(fā)揮腫瘤啟動(dòng)子的作用[8]。CDCA6和CDCA7的異常表達(dá)在前列腺癌、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌和食管癌中被發(fā)現(xiàn)[9-10]。CDCA8的表達(dá)可被KIF18B激活，進(jìn)而影響胰腺導(dǎo)管腺癌的增殖[11]。以上說(shuō)明CDCAs基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。

本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDCAs基因在胃癌中的表達(dá)水平，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CDCAs基因在胃癌中的表達(dá)水平，結(jié)合Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床信息分析CDCA基因家族成員在胃癌中的預(yù)后結(jié)果；利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建CDCAs基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并得到與CDCA基因家族共表達(dá)的基因；利用metascape數(shù)據(jù)庫(kù)將CDCAs基因及其共表達(dá)基因的功能信息進(jìn)行整合，研究其潛在的作用機(jī)制。以上生物信息學(xué)分析結(jié)果有望為尋找胃癌有效的預(yù)后標(biāo)志物提供新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析 本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.oncomine.org/)分析正常胃組織和胃癌組織。設(shè)定篩選條件：(1)gene：CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8；(2)fold change >2，P<0.05，gene rank = top 10%。

1.2GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)可利用TCGA和GTEx直接進(jìn)行CDCAs基因的表達(dá)分析。設(shè)置限定條件：|Log2FC|Cutoff: 1，P值 Cutoff: 0.05。

1.3Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis)數(shù)據(jù)庫(kù)采用Kaplan-Meier法對(duì)多種腫瘤患者的生存資料進(jìn)行預(yù)后分析。篩選條件如下：(1)cancer：gastric cancer；(2)gene symbol：CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8；(3)Split patients by: best cutoff；(4)survival：OS。在進(jìn)行總生存期(overall survival，OS)分析的同時(shí)，計(jì)算危險(xiǎn)比(hazard radio，HR)、95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)及LongrankP<0.05檢驗(yàn)差異，LogrankP<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)是一個(gè)在線搜索已知的蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究于2020年12月28日訪問(wèn)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)11.0版。選擇Multiple Proteins板塊，條件設(shè)置為：(1)List Of Names: CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8；(2)Organism: Homo sapiens；(3)minimum required interaction score: medium confidence(0.400)。

1.5metascape數(shù)據(jù)庫(kù)分析 metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org)整合了GO和KEGG等多個(gè)數(shù)據(jù)資源，可完成通路富集和相關(guān)基因的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析等。條件設(shè)置為：(1)Multiple Gene List: CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8；(2)Input as species and Analysis as species: H.sapiens。最后進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者CDCA基因的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示：CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8在胃癌組織中顯著升高(圖1)。分析三個(gè)數(shù)據(jù)集“Cui Gastric”，“Derrico Gastric”和“Cho Gastric”，得到CDCA基因家族在胃癌組織和正常組織的差異表達(dá)分析結(jié)果(表1)。

表1 不同類(lèi)型胃癌與正常肺組織之間CDCA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異顯著

圖1 CDCA在不同腫瘤中的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)

2.2GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者CDCA基因的表達(dá)情況 結(jié)果顯示，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA4、CDCA5、CDCA6、CDCA7、CDCA8的表達(dá)水平在胃癌組織中相對(duì)于在正常組織中上調(diào)(腫瘤樣本:n=408，正常樣本:n=211，P<0.05)(圖2)。

圖2 CDCA基因家族在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)

2.3Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)中CDCA基因家族在胃癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理資料的生存分析 結(jié)果顯示，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDA4、CDCA5、CDCA7、CDCA8的表達(dá)高低與預(yù)后相關(guān)。以HER2(+)/(-)和不同臨床分期為前提條件進(jìn)行生存分析，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA7、CDCA8基因高表達(dá)胃癌患者的總生存期較低表達(dá)胃癌患者的總生存期顯著延長(zhǎng)，而CDCA4基因低表達(dá)胃癌患者預(yù)后更好(圖3)。見(jiàn)表2、3。

圖3 胃癌患者CDCA基因家族的OS分析

表2 CDCA基因家族表達(dá)與胃癌患者HER2(-)/(+)的相關(guān)性

2.4STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者CDCA基因的通路富集分析 結(jié)果顯示，CDCAs基因在胃癌中呈正相關(guān)的共表達(dá)基因?yàn)椋篊DCA2、CDCA7、CDCA4、CDCA1(NUF2)、CDCA3、CDCA6(CBX2)、CDCA8、CDCA5、NDC80、SPC25、BIRC5、BUB1、AURKB、CDC20、INCENP、SPC24、CCNB1和CENPE，作用評(píng)分均大于0.99(圖4a、4b)。

表3 CDCA基因家族表達(dá)與胃癌患者分期的相關(guān)性

圖4a CDCAs基因基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的蛋白質(zhì)互作分析

圖4b CDCAs基因基于STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的基因共表達(dá)分析

2.5metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌患者CDCA基因的功能預(yù)測(cè) 結(jié)果顯示，CDCA基因的改變影響了以下幾個(gè)過(guò)程：(1)R-HAS-2500257: 分辨姐妹染色單體粘連；(2)M129: PID PLK1通路；(3)M14: PID AURORA B通路；(4)CORUM:127: NDC80著絲點(diǎn)復(fù)合體；(5)GO:0030261: 染色體凝縮；(6)GO:0140013: 減數(shù)分裂(圖5a、5b和5c)。

圖5 CDCAs基因的功能以及與CDCAs基因改變顯著相關(guān)的功能

3 討論

近年來(lái)有研究表明CDCA基因家族可能有助于腫瘤的發(fā)展[12]，但目前較少有胃癌中CDCA基因家族的表達(dá)情況和預(yù)后分析的相關(guān)報(bào)道。細(xì)胞周期異常調(diào)節(jié)所介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)為腫瘤的增殖提供了有利條件，因此腫瘤的發(fā)生發(fā)展離不開(kāi)細(xì)胞分裂[13]。值得注意的是CDCA基因家族部分家族成員在腫瘤中高表達(dá)，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、減少腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，導(dǎo)致預(yù)后不良[14]。本研究利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，均提示CDCA基因家族8個(gè)成員的mRNA在胃癌組織中呈高表達(dá)，說(shuō)明CDCA基因家族成員可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。

有報(bào)道CDCA基因家族的一些成員可能在乳腺癌、肺腺癌和胰腺癌中上調(diào)，這些基因的高表達(dá)水平被認(rèn)為是這些腫瘤生存的不良預(yù)測(cè)因素[12]。本研究利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存分析，結(jié)果表明除CDCA6基因差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CDCA基因家族另外7個(gè)成員中，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA7、CDCA8的高表達(dá)與胃癌患者的總生存期延長(zhǎng)有關(guān)，CDCA4在胃癌中的高表達(dá)，與胃癌患者的總生存期減少有關(guān)。本研究以HER2(+)/(-)和不同臨床分期為前提條件進(jìn)行分析，CDCA4基因表達(dá)下調(diào)，CDCA1、CDCA2、CDCA3、CDCA5、CDCA7、CDCA8基因表達(dá)部分上調(diào)。已有報(bào)道胃癌HER2狀態(tài)和胃癌的預(yù)后有一定的相關(guān)性[15]。值得注意的是，本研究中以HER2(+)/(-)和不同臨床分期為前提條件的結(jié)果與胃癌患者總生存期結(jié)果相比結(jié)果有差異，說(shuō)明CDCA基因家族基因在胃癌組織中的表達(dá)情況可能與HER2通路有關(guān)，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。另外，本研究CDCA6基因的mRNA在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，但其表達(dá)水平對(duì)胃癌患者生存期無(wú)明顯影響，推測(cè)可能CDCA6的功能主要作用在于腫瘤的發(fā)生，對(duì)胃癌患者后期影響較小。

此外，為探討CDCA基因家族成員影響胃癌預(yù)后的機(jī)制，本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了KEGG和GO的分析，找出CDCAs基因表達(dá)和突變頻率最高的連鎖基因與胃癌預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果是CDCAs基因改變會(huì)影響以下途徑：(1)R-HAS-2500257: 分辨姐妹染色單體粘連；(2)M129: PID PLK1通路；(3)M14: PID AURORA B通路；(4)CORUM:127: NDC80著絲點(diǎn)復(fù)合體；(5)GO:0030261: 染色體凝縮；(6)GO:0140013: 減數(shù)分裂。凝縮后的染色體包含兩個(gè)姊妹染色單體，兩單體由著絲粒連接。研究發(fā)現(xiàn)，PLK1是有絲分裂激酶信號(hào)的主要調(diào)節(jié)者和協(xié)調(diào)者，而AURORA B就是有絲分裂激酶成員之一[16]。PLK1通過(guò)調(diào)節(jié)AURORA B的活性確定著絲粒的身份，AURORA B激酶通過(guò)磷酸化著絲粒上的NDC80蛋白，調(diào)控NDC80寡聚化作用來(lái)糾正錯(cuò)誤的微管-動(dòng)粒連接，動(dòng)粒與微管正確連接的前提是姐妹染色單體的正常粘連[16-18]。本研究推測(cè)CDCAs基因及其突變頻率最高的連鎖基因可能通過(guò)調(diào)控PID PLK1和PID AURORA B信號(hào)通路影響NDC80著絲點(diǎn)復(fù)合體，進(jìn)而干擾動(dòng)粒與微管的連接影響姐妹染色單體粘連，最終影響染色體的穩(wěn)定性，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)失控。因此，對(duì)CDCAs基因表達(dá)的調(diào)控，有望通過(guò)調(diào)節(jié)上述信號(hào)通路影響染色體的穩(wěn)定性，將胃癌細(xì)胞阻滯在有絲分裂期，使胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)，探討CDCAs基因的表達(dá)水平與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，提示CDCAs基因表達(dá)水平可能與胃癌的預(yù)后相關(guān)。篩選CDCAs基因在胃癌中的共表達(dá)基因然后進(jìn)行GO和KEGG富集分析，探討了其可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制。目前，檢測(cè)CDCAs基因的異常表達(dá)可能為胃癌患者早期診斷和預(yù)后提供新思路，并可能為胃癌的預(yù)后診療提供新的方法和新的理論依據(jù)。同時(shí)，深入研究CDCA基因家族成員在腫瘤的發(fā)生發(fā)展也為研究其他胃腸道腫瘤提供新的思路和方向。