楊舒萍, 楊 帆, 董四君, 顏昌宙*

1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所, 城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 廈門 361021 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002

砷(arsenic，As)作為一種豐富的自然元素和重要的環(huán)境污染物，對(duì)水生生物及人類健康均具有嚴(yán)重危害[1-2]. 有關(guān)As對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，國內(nèi)外均有大量報(bào)道[3-4]. 在真實(shí)的水環(huán)境中，As的生物可利用性和毒理效應(yīng)可能會(huì)受到環(huán)境中廣泛存在的納米顆粒物的影響. 因此，在研究As對(duì)水生生物毒性效應(yīng)時(shí)，有必要考慮人工納米顆粒的影響及其潛在的復(fù)合毒性效應(yīng)，這對(duì)深入了解As的環(huán)境行為及生態(tài)毒理效應(yīng)具有重要意義.

納米二氧化鈦(titanium dioxide nanoparticles，nano-TiO2)是目前應(yīng)用最廣泛的納米材料之一[5-6]. 近年來已有關(guān)于nano-TiO2對(duì)As載體效應(yīng)的研究，即As能以As-nano-TiO2復(fù)合物的形式進(jìn)入生物體內(nèi)，導(dǎo)致其生物利用性和毒性增強(qiáng)[7-8]. 然而，也有研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，由于nano-TiO2對(duì)As的吸附作用導(dǎo)致暴露介質(zhì)或生物體內(nèi)As有效濃度降低而引起As毒性減弱. 這些研究結(jié)果的差異性可能主要與nano-TiO2晶型、濃度、受試生物以及試驗(yàn)體系不同有關(guān). 另外，nano-TiO2對(duì)As的生物利用性及其毒性效應(yīng)的影響還可以通過生殖及攝食行為進(jìn)行傳遞，對(duì)下一代及高營養(yǎng)級(jí)生物造成難以預(yù)估的風(fēng)險(xiǎn)[11-12]. 因此，進(jìn)一步探究nano-TiO2與As的復(fù)合毒性效應(yīng)十分必要. 相較于淡水環(huán)境，研究人員對(duì)咸水環(huán)境中nano-TiO2與As交互作用及二者復(fù)合毒性效應(yīng)的關(guān)注較少. 由于咸水環(huán)境具有高鹽度、高離子強(qiáng)度的特點(diǎn)，使得nano-TiO2在咸水環(huán)境中的行為及歸趨不同于淡水環(huán)境，因此亟需加強(qiáng)nano-TiO2與As對(duì)咸水生物的復(fù)合毒性效應(yīng)研究. 此外，目前有關(guān)nano-TiO2與As的復(fù)合毒性效應(yīng)研究均基于急性毒性試驗(yàn)，而實(shí)際環(huán)境中生物體往往是持續(xù)暴露于多種污染物中，因此在生物體整個(gè)生命周期內(nèi)考察污染物的慢性復(fù)合毒性效應(yīng)可能更具有實(shí)際意義.

該研究以咸水環(huán)境中的浮游動(dòng)物——豐年蝦(Artemiasalina)為模式生物[13]，通過觀察五價(jià)砷〔arsenate，As(Ⅴ)〕和nano-TiO2在單獨(dú)和聯(lián)合暴露條件下對(duì)豐年蝦存活率、生長發(fā)育狀況、腸道形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響，并測定豐年蝦對(duì)As攝入、累積量以及As在豐年蝦體內(nèi)各亞細(xì)胞組分分布情況，揭示在nano-TiO2存在條件下As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦的慢性毒性效應(yīng)，以期為系統(tǒng)認(rèn)識(shí)咸水體系中nano-TiO2和As復(fù)合毒性效應(yīng)與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Nano-TiO2(銳鈦礦，純度≥99.7%，平均粒徑<25 nm，表面積為45～55 m2/g)購自美國西格瑪奧德里奇公司，用于制備濃度為1 g/L nano-TiO2儲(chǔ)備液，室溫避光保存?zhèn)溆? 為了使nano-TiO2顆粒分散均勻，每次使用前需將nano-TiO2儲(chǔ)備液冰浴超聲20 min (40 kHz). 十二水砷酸鈉(Na3AsO4·12H2O，分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于制備As(Ⅴ)(1 g/L)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆? 觀賞魚類海水晶(中鹽工程技術(shù)研究院有限公司)用于配置人工海水(30‰)，人工海水需過濾(0.45 μm，Millipore)后使用. Nano-TiO2在人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)中形貌特征、水合粒徑和zeta電位在筆者課題組先前研究[12]中已進(jìn)行表征. 該試驗(yàn)涉及的其他化學(xué)試劑(分析純)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 豐年蝦孵化與培養(yǎng)

豐年蝦(A.salina)滯育卵購自當(dāng)?shù)厮屦^，置于-20 ℃冰箱中解除滯育. 使用曝氣24 h人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)孵化豐年蝦，具體孵化步驟參考文獻(xiàn)[7]. 新孵化的豐年蝦Ⅰ齡無節(jié)幼蟲轉(zhuǎn)移到新鮮人工海水中無喂食培養(yǎng)24 h，豐年蝦Ⅱ齡無節(jié)幼蟲即可用于毒性試驗(yàn).

1.3 試驗(yàn)設(shè)置

試驗(yàn)設(shè)置1個(gè)As(Ⅴ)濃度(0.1 mg/L)和2個(gè)nano-TiO2濃度(1和10 mg/L)，組別設(shè)置如表1所示，所有處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)兩次. 用曝氣24 h的人工海水(30‰，pH=8.0±0.1)及預(yù)先配置好的As(Ⅴ)和nano-TiO2儲(chǔ)備液配置暴露溶液，待As(Ⅴ)在nano-TiO2上吸附平衡后(1 h)即可接入豐年蝦[7]. 每個(gè)培養(yǎng)皿(15 cm)含200 mL暴露溶液及400只豐年蝦Ⅱ齡幼蟲. 培養(yǎng)條件：溫度(25±2)℃；光照/黑暗循環(huán)為16 h/8 h，光照強(qiáng)度為 4 000 lx. 試驗(yàn)為期28 d，每天喂食杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)(4×104cells/mL)2次，每周更換3次暴露溶液.

表1 豐年蝦28 d長期慢性毒性試驗(yàn)組別設(shè)置

1.4 豐年蝦存活率及體長測定

暴露期間，每天記錄豐年蝦死亡個(gè)體數(shù)，計(jì)算存活率. 另外，每周測定豐年蝦體長，具體方法：在暴露第7、14、21和28天，隨機(jī)選取5只豐年蝦置于4%甲醛溶液中進(jìn)行固定，隨后置于載玻片上，于倒置電子顯微鏡(AE31，Motic，德國)下測定體長. 豐年蝦頭部到尾叉之間的距離即為體長.

1.5 豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)觀察

暴露結(jié)束后，采用倒置電子顯微鏡觀察豐年蝦形態(tài)變化，并拍照記錄. 另外，參考Bacchetta等[14]方法制作生物樣品超薄切片，采用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM；H-7650，Hitachi，日本)觀察豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)變化.

1.6 豐年蝦對(duì)As的攝入與累積

在暴露第7、14、21和28天收集生物樣品(n=50)，洗滌后(超純水沖洗1 min，0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡30 s，超純水沖洗1 min)均分成兩部分. 其中，一部分直接冷凍干燥至恒重，消解后用于測定豐年蝦對(duì)As的攝入；另一部分轉(zhuǎn)至干凈人工海水中，凈化10 h[7]后冷凍干燥至恒重，消解后用于測定豐年蝦對(duì)As的累積，消解過程參考文獻(xiàn)[15]的方法. 消解結(jié)束后，樣品用2% HNO3溶液稀釋定容，過濾后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(7500Cx型，Agilent，美國)測定樣品中的As含量，豐年蝦對(duì)As的攝入及積累量均用μg/g (以干質(zhì)量計(jì))表示. 同時(shí)測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紫菜(GBW08521，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)中的As含量，從而對(duì)消解過程進(jìn)行質(zhì)控. 另外，豐年蝦攝入體內(nèi)的部分As能在凈化過程中通過排泄作用排出體外，可根據(jù)式(1)計(jì)算凈化過程中豐年蝦對(duì)As的平均排泄速率.

νd=(cu-ca)/10

(1)

式中：νd為As平均排泄速率，μg/(g·h)；cu、ca分別為豐年蝦對(duì)As的攝入量及累積量，μg/g.

1.7 As在豐年蝦各亞細(xì)胞組分中的分布

按1.6節(jié)中方法收集、洗滌和凈化生物樣品(n=25)，隨后將樣品置于組織勻漿器中勻漿(加入1 mL 0.9%預(yù)冷生理鹽水). 采用差速離心法(見圖1)將生物組織勻漿分為5部分，分別為細(xì)胞碎屑組分、富金屬礦體(metal rich granules，MRG)組分、細(xì)胞器組分、熱穩(wěn)定蛋白(heat-stable protein，HSP)組分和熱敏感蛋白(heat-denatured protein，HDP)組分[16]. 所有亞細(xì)胞組分均按1.6節(jié)所述方法冷凍干燥、消解和測定分析. 結(jié)果以各組分中As含量占5個(gè)亞細(xì)胞組分中As總含量的比例表示.

圖1 分離各亞細(xì)胞組分的差數(shù)離心法[16]Fig.1 Differential centrifugation procedure for separating each subcellular fraction[16]

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)處理組之間差異進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P值小于0.05時(shí)表示差異顯著.

2 結(jié)果與討論

2.1 豐年蝦存活率及體長變化

Nano-TiO2與As(Ⅴ)單獨(dú)或聯(lián)合暴露28 d過程中豐年蝦存活率變化如圖2所示. 由圖2可見：暴露結(jié)束后，對(duì)照組存活率大于95%，5個(gè)試驗(yàn)組最終存活率在60%～90%之間，其中，1TiO2試驗(yàn)組和10TiO2試驗(yàn)組最終存活率(約為90%)與對(duì)照組之間差異不顯著，而0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組(約為80%)、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組(約為70%)和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組(約為60%)最終存活率均明顯低于對(duì)照組(P均小于0.05). 與As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組相比，nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露組豐年蝦存活率進(jìn)一步下降，且0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組之間存在顯著差異(P<0.05). 由圖3可見：各處理組豐年蝦體長均隨暴露時(shí)間的增長而增加. 暴露第14天時(shí)豐年蝦體長比暴露第7天時(shí)增長近40%；而在暴露第14、21和28天時(shí)，豐年蝦體長基本維持在同一水平，體長約為 1 000 μm. 整個(gè)暴露過程中，5個(gè)試驗(yàn)組豐年蝦體長均略小于對(duì)照組，但與對(duì)照組均不存在顯著差異(P>0.05).

圖2 28 d慢性暴露過程中豐年蝦存活曲線Fig.2 Survival curves of A. salina under 28 d of chronic exposure

圖3 28 d慢性暴露過程中豐年蝦體長的變化Fig.3 Change of body length of A. salina under 28 d of chronic exposure

由于在整個(gè)暴露過程中nano-TiO2單獨(dú)暴露組(1TiO2試驗(yàn)組和10TiO2試驗(yàn)組)豐年蝦的存活率及生長率與對(duì)照組之間差異均不顯著，因此在該研究中可以認(rèn)為nano-TiO2對(duì)豐年蝦的毒性效應(yīng)較低，可以忽略其直接的毒理效應(yīng)，重點(diǎn)關(guān)注聯(lián)合暴露條件下As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦的毒性效應(yīng)以及nano-TiO2對(duì)豐年蝦毒性的影響. 已有研究[17]證實(shí)，As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦全生命周期存在慢性毒性作用，毒性指標(biāo)主要集中在存活率、生長率及繁殖率. 筆者研究中nano-TiO2與As(Ⅴ)單獨(dú)或聯(lián)合慢性暴露導(dǎo)致豐年蝦體長雖略有下降，但與對(duì)照組相比并不存在顯著差異；相反，0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦存活率顯著低于對(duì)照組，因此推測與生長率相比，存活率可能是生物體在暴露過程中最敏感的毒性指標(biāo). 與筆者研究結(jié)果類似，Brix等[17]將豐年蝦Ⅰ齡幼蟲暴露于不同濃度的As(Ⅴ)溶液28 d，發(fā)現(xiàn)不同暴露濃度對(duì)豐年蝦親代及子代生長率均沒有顯著影響，且子代對(duì)As(Ⅴ)敏感度降低，而親代豐年蝦存活率比對(duì)照組顯著下降. 另外，相比As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組，添加nano-TiO2后豐年蝦存活率進(jìn)一步下降，揭示nano-TiO2對(duì)As(Ⅴ)毒性有增強(qiáng)作用. 與筆者研究結(jié)果類似，Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)網(wǎng)紋蚤(Ceriodaphniadubia)同時(shí)暴露于As(Ⅴ)和nano-TiO2時(shí)，As(Ⅴ)對(duì)網(wǎng)紋蚤半致死濃度由As(Ⅴ)單獨(dú)暴露下的3.68 mg/L降至1.43 mg/L；Fan等[11]發(fā)現(xiàn)，As〔As(Ⅴ)和As(Ⅲ)〕與nano-TiO2聯(lián)合暴露下大型蚤(Daphniamagna)存活率均明顯低于As單獨(dú)暴露條件下.

2.2 豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化

暴露結(jié)束后，5個(gè)試驗(yàn)組豐年蝦生長發(fā)育進(jìn)程與對(duì)照組相比并沒有顯著差別，各處理組豐年蝦均發(fā)育完全，在胸部均可觀察到11對(duì)附肢. 然而通過觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2單獨(dú)暴露下豐年蝦腸道形態(tài)未見明顯破壞，而As(Ⅴ)暴露組〔0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組〕豐年蝦腸道正常形態(tài)被破壞，腸道腫脹變形，且As(Ⅴ)與nano-TiO2聯(lián)合暴露下破壞作用更明顯(見圖4). 在0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組中腸道腫脹的豐年蝦占比分別為60%、60%和80%.

注：紅色虛線方框內(nèi)指示豐年蝦腸道腫脹變形.圖4 暴露28 d后豐年蝦腸道形態(tài)特征Fig.4 Morphological characteristics of intestine of A. salina after exposed for 28 d

為了進(jìn)一步探究豐年蝦腸道出現(xiàn)腫脹變形的原因，筆者同時(shí)觀察了豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu). 由圖5可見：對(duì)照組豐年蝦腸道上皮細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完好，腸道微絨毛排列整齊，未見明顯損傷；而各試驗(yàn)組豐年蝦腸道微絨毛排列雜亂，且與對(duì)照組相比，腸道微絨毛密度降低(見圖5藍(lán)色箭頭指示處). 在5個(gè)試驗(yàn)組中，每個(gè)試驗(yàn)組各觀察10個(gè)豐年蝦腸道電鏡圖，發(fā)現(xiàn)1TiO2試驗(yàn)組和10TiO2試驗(yàn)組中腸道微絨毛密度降低的豐年蝦占比較小，分別為10%和30%；而0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組、1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組中腸道微絨毛密度降低的豐年蝦占比分別達(dá)60%、60%和70%. 另外，0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦腸道上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞質(zhì)空洞化和細(xì)胞質(zhì)纖維化〔見圖5(b)〕. 當(dāng)添加nano-TiO2后，細(xì)胞質(zhì)空洞化及纖維化程度加深，且與1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組相比，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)破壞更為嚴(yán)重〔見圖5(e)(f)〕. 在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組還觀察到了腸道上皮細(xì)胞脫離腸壁的現(xiàn)象〔見圖5(f)〕.

功能器官結(jié)構(gòu)變化是生物體在不利環(huán)境條件脅迫下受到毒性作用的直接表現(xiàn)，也是分析污染物對(duì)其毒性的重要指標(biāo)[17]. 腸道作為動(dòng)物重要的消化、吸收和免疫器官，是生物體抵御外源性物質(zhì)入侵的關(guān)鍵防線[19]. 研究[20-22]表明，不論是重金屬暴露、納米材料暴露或是二者聯(lián)合暴露，都可能導(dǎo)致生物體腸道受損，直觀表現(xiàn)為腸道變形，微觀表現(xiàn)為腸道上皮細(xì)胞損傷、腸黏膜損傷、炎癥和腸道微生物群紊亂. 腸道損傷會(huì)影響消化系統(tǒng)正常運(yùn)行，最終對(duì)生物體造成不良影響[23]. 筆者研究中5個(gè)試驗(yàn)組豐年蝦均存在腸道微絨毛排列雜亂、密度降低的情況，這可能預(yù)示著暴露導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生[24]. 此外，nano-TiO2單獨(dú)暴露對(duì)豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)并未產(chǎn)生其他顯著影響，進(jìn)一步揭示了nano-TiO2對(duì)豐年蝦的低毒性. 然而，不論是As(Ⅴ)單獨(dú)暴露或與nano-TiO2聯(lián)合暴露均對(duì)豐年蝦腸道形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)造成顯著破壞. 與筆者研究結(jié)果類似，Shi等[25]將鰷魚(Gobiocyprisrarus)暴露于不同濃度的As(Ⅲ)溶液96 h，TEM結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，暴露組鰷魚腸道存在大量細(xì)胞和組織病變，表現(xiàn)為腸道外觀不規(guī)則、腸絨毛變性破裂、腸壁皺襞萎縮、腸道上皮細(xì)胞增生和腫大. 與存活率結(jié)果相似，nano-TiO2參與下As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦腸道破壞作用加劇. Liu等[22]探究Cu2+與兩種nano-TiO2(親水型與疏水型)對(duì)大型蚤聯(lián)合毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：疏水型nano-TiO2存在時(shí)Cu的生物積累增加，可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷；而親水型nano-TiO2對(duì)Cu毒性的促進(jìn)作用可能與nano-TiO2加劇大型蚤腸黏膜機(jī)械損傷有關(guān). 因此，nano-TiO2導(dǎo)致重金屬離子毒性效應(yīng)增強(qiáng)的機(jī)制與nano-TiO2種類、受試生物種類以及試驗(yàn)設(shè)置緊密相關(guān). 已有研究主要基于短期急性暴露試驗(yàn)，長期慢性暴露下nano-TiO2對(duì)As(Ⅴ)毒性的增加效應(yīng)的研究仍需進(jìn)一步加強(qiáng).

注： *表示攝入量與累積量之間存在顯著性差異(P<0.05). As攝入量與積累量以干質(zhì)量計(jì).圖6 28 d慢性暴露下豐年蝦對(duì)As的攝入與累積Fig.6 The uptake and accumulation of As in A. salina under 28 d of chronic exposure

2.3 豐年蝦對(duì)As的攝入與累積

由圖6可見：各試驗(yàn)組豐年蝦在暴露第7、14、28天時(shí)對(duì)As的攝入和累積并沒有顯著差異；但在暴露第21天時(shí)，豐年蝦對(duì)As的攝入和累積比第7、14、28天時(shí)顯著下降. 由于14～21 d是豐年蝦主要產(chǎn)卵(子)期，因此豐年蝦可能通過子代轉(zhuǎn)移部分As，這與Luo等[8]研究結(jié)果一致. 與0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組相比，添加nano-TiO2后豐年蝦對(duì)As的攝入和累積均增加，且暴露后期(第21和28天)，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的攝入與累積均顯著增加(P<0.05). 另外，通過對(duì)比豐年蝦對(duì)As的攝入與累積差異發(fā)現(xiàn)，0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的攝入與累積并無顯著差異，1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的攝入在暴露第21天時(shí)顯著高于對(duì)As的累積，而10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的攝入在整個(gè)暴露過程中都明顯高于對(duì)As的累積.

為了探究As(Ⅴ)單獨(dú)暴露或與nano-TiO2聯(lián)合暴露下豐年蝦對(duì)As的排泄能力，該研究計(jì)算了不同處理下豐年蝦對(duì)As的平均排泄速率(凈化10 h). 由圖7可見：0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的平均排泄速率隨暴露時(shí)間的延長并未出現(xiàn)明顯變化；而1TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組和10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的平均排泄速率均隨暴露時(shí)間的延長而下降. 在暴露前期(第7和14天)，nano-TiO2能顯著提高豐年蝦對(duì)As的平均排泄速率；然而在暴露后期(第21和28天)，添加nano-TiO2對(duì)As平均排泄速率沒有顯著影響.

注： 不同小寫字母表示試驗(yàn)組之間存在顯著性差異(P<0.05).圖7 豐年蝦在10 h凈化過程中對(duì)As的 平均排泄速率Fig.7 The average excretion rate of As during 10 h of purification in A. salina

已有研究[7-8,26]發(fā)現(xiàn)，海洋微藻(Nannochloropsismaritima)、豐年蝦(A.salina)和大型蚤(D.magna)中均可觀察到nano-TiO2對(duì)As的載體效應(yīng). 作為典型非選擇性濾食生物，豐年蝦能夠隨機(jī)攝取周圍環(huán)境中1～50 μm顆粒物質(zhì)[23]. Yan等[7]探究了nano-TiO2在人工海水中的行為及對(duì)As(Ⅴ)的吸附，結(jié)果表明，nano-TiO2在人工海水中能迅速發(fā)生團(tuán)聚使得nano-TiO2(1和10 mg/L)及As-nano-TiO2復(fù)合物的水合粒徑在1.0～1.5 μm之間，存在被豐年蝦攝取的可能，而攝取As-nano-TiO2復(fù)合物增加了豐年蝦對(duì)As的攝入. 筆者研究中，與0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組相比，nano-TiO2存在下〔10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組〕豐年蝦對(duì)As的攝入顯著增加(P<0.05)；同時(shí)，添加nano-TiO2會(huì)導(dǎo)致豐年蝦對(duì)As的排泄作用顯著增加(第7和14天)，最終導(dǎo)致各試驗(yàn)組豐年蝦對(duì)As的累積無顯著差異(P>0.05). 結(jié)果表明，生物體對(duì)化學(xué)物質(zhì)攝入量并不能真實(shí)反映生物體對(duì)化學(xué)物質(zhì)的累積及生物利用情況，尤其是在與nano-TiO2等“載體”共存條件下，化學(xué)物質(zhì)毒性機(jī)理可能不僅與nano-TiO2載體效應(yīng)有關(guān)，也可能與nano-TiO2無生物可利用性而被生物體快速排泄緊密相關(guān). 然而，隨著暴露時(shí)間的延長(第21和28天)，nano-TiO2對(duì)豐年蝦As平均排泄速率的影響逐漸消失，而nano-TiO2對(duì)As的載體效應(yīng)依舊顯著，導(dǎo)致暴露后期nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露組中豐年蝦對(duì)As的累積顯著高于As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組，這也可能是暴露后期聯(lián)合暴露組豐年蝦腸道超微結(jié)構(gòu)破壞作用更為嚴(yán)重的原因之一.

2.4 As在豐年蝦各亞細(xì)胞組分中的分布

注：不同小寫字母表示試驗(yàn)組之間存在顯著性差異(P<0.05).圖8 As在豐年蝦各亞細(xì)胞組分中的分布情況Fig.8 Distribution of As in different subcellular fractions of A. salina

單獨(dú)和聯(lián)合暴露條件下，As在豐年蝦各亞細(xì)胞組分(細(xì)胞碎屑組分、MRG組分、HSP組分、細(xì)胞器組分、HDP組分)中分布情況如圖8所示. 由圖8可見：在整個(gè)暴露階段，As主要分布在豐年蝦細(xì)胞碎屑組分(22.98%～66.91%)及HSP組分(15.47%～57.25%). 在暴露前期(第7和14天)，As在細(xì)胞碎屑組分中的相對(duì)含量隨暴露時(shí)間延長而增加；相反，As在HSP組分中的相對(duì)含量隨暴露時(shí)間延長而降低. 在暴露后期(第21和28天)，As在細(xì)胞碎屑組分及HSP組分中的相對(duì)含量基本相同. 與As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組相比，As在聯(lián)合暴露組細(xì)胞碎屑組分中的相對(duì)含量增加，特別是在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組(第7天，p>0.05；第14、21、28天，p均小于0.05). 在暴露第14、21和28天時(shí)，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組中As在豐年蝦細(xì)胞碎屑組分中相對(duì)含量分別比As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組顯著增加了24.55%±6.23%、33.13%±3.52%和46.68%±8.35%. 與此相反，與As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組相比，聯(lián)合暴露組As在HSP組分中的相對(duì)含量下降，特別是在10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組(第7天，p>0.05；第14、21、28天，p均小于0.05). 在暴露第7、14、21和28天時(shí)，10TiO2+0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組中As在豐年蝦HSP組分中的相對(duì)含量分別比0.1As(Ⅴ)試驗(yàn)組降低了20.74%±2.80%、39.83%±9.54%、43.27%±5.29%和50.91%±7.60%.

細(xì)胞碎屑組分一般由細(xì)胞膜(壁)及組織碎片等組成[27]. 細(xì)胞膜(壁)上富含官能基團(tuán)，可通過靜電吸附、化學(xué)絡(luò)合等作用將金屬離子隔絕在細(xì)胞外[28]，從而導(dǎo)致金屬離子在細(xì)胞碎屑組分中分布比例較高. 研究[7]發(fā)現(xiàn)，顆粒結(jié)合態(tài)金屬穿膜能力弱于自由離子態(tài)金屬. 筆者研究表明，在nano-TiO2存在條件下As在細(xì)胞碎屑組分中的相對(duì)含量增加，說明由于nano-TiO2對(duì)As(Ⅴ)的吸附作用，As-nano-TiO2復(fù)合物比離子態(tài)As更易被細(xì)胞膜阻隔，使得聯(lián)合暴露組As穿膜能力顯著下降，從而導(dǎo)致聯(lián)合暴露組As在細(xì)胞碎屑組分中的相對(duì)含量高于As(Ⅴ)單獨(dú)暴露組，這與Yang等[26,29]研究結(jié)果一致；同時(shí)，As在細(xì)胞碎屑組分中相對(duì)含量的增加導(dǎo)致As在細(xì)胞器、酶等生物活性組分中的相對(duì)含量降低，在一定程度上緩解了As對(duì)豐年蝦的毒性作用，使豐年蝦可以在較長時(shí)間暴露下維持正常生長發(fā)育. 然而，一部分As仍能夠通過細(xì)胞膜上的離子通道或胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，對(duì)生物體產(chǎn)生不良影響.

與MRG和HSP組分結(jié)合的金屬通常被定義為生物解毒金屬(biologically detoxified metal，BDM)，即金屬可以通過與HSP組分結(jié)合或通過將金屬沉淀成MRG的方式解毒[30]. 筆者研究中As在HSP組分中相對(duì)含量較高，說明HSP組分可能參與了豐年蝦對(duì)As的解毒. Wang等[31]研究證明，As暴露下牡蠣(Crassostreaangulata和Crassostreahongkongensis)通過將體內(nèi)大部分As分配到HSP組分而解毒. Velez等[32]研究表明，蛤蜊(Venerupiscorrugata)體內(nèi)累積的As主要分布在HSP組分，表明該組分在As的隔離和穩(wěn)態(tài)中起重要作用. HSP組分一般由富含巰基的金屬硫蛋白以及其他巰基化合物和多肽(如谷胱甘肽)組成[33]. 生物體暴露于某些未知生物學(xué)功能的金屬(如Cd、Cu或As等)能誘導(dǎo)生物體內(nèi)產(chǎn)生低分子量金屬結(jié)合蛋白，表明細(xì)胞具有識(shí)別有毒金屬并對(duì)其作出反應(yīng)的獨(dú)特能力，這對(duì)生物體內(nèi)微量金屬代謝和毒理學(xué)研究起重要作用[34]. Cd、Cu或As等金屬離子對(duì)巰基的親和力較高，研究[35-37]發(fā)現(xiàn)，生物體處于Cd、Cu或As等離子暴露下也會(huì)出現(xiàn)金屬硫蛋白中金屬含量增加的現(xiàn)象. 這種金屬離子與富含硫基的HSP組分之間的相互作用被認(rèn)為是生物體對(duì)非必需金屬離子的一種解毒機(jī)制，即二者相互作用限制金屬離子在生物體內(nèi)的移動(dòng)與轉(zhuǎn)移，金屬離子處于隔離狀態(tài)從而不能與蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞器等生物敏感組分相互作用，從而降低其毒性效應(yīng)[33]. 然而在筆者研究中，添加nano-TiO2后As在HSP組分中相對(duì)含量下降，說明nano-TiO2抑制了豐年蝦對(duì)As的解毒過程. Fan等[38]研究提出，nano-TiO2存在時(shí)一部分Cu2+與nano-TiO2通過形成Cu—O鍵而被吸附，吸附態(tài)Cu不能有效誘導(dǎo)金屬硫蛋白形成，從而導(dǎo)致聯(lián)合暴露組大型蚤體內(nèi)金屬硫蛋白含量顯著低于單獨(dú)暴露組. 由于As(Ⅴ)也能通過與nano-TiO2形成As—O鍵而被吸附[39]，筆者推測這種吸附作用可能也會(huì)干擾As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦體內(nèi)金屬硫蛋白形成的誘導(dǎo)作用，使得As在HSP組分中相對(duì)含量下降. 因此，nano-TiO2存在時(shí)As與金屬硫蛋白絡(luò)合的解毒過程受限，這可能是nano-TiO2增強(qiáng)As毒性效應(yīng)的重要原因之一.

3 結(jié)論

a) Nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露顯著增強(qiáng)As(Ⅴ)對(duì)豐年蝦的慢性毒性效應(yīng)，導(dǎo)致豐年蝦存活率顯著降低及腸道損傷加劇.

b) 在Nano-TiO2與As(Ⅴ)聯(lián)合暴露后期(第21和28天)，nano-TiO2促進(jìn)豐年蝦排泄As的效應(yīng)減弱，導(dǎo)致聯(lián)合暴露組豐年蝦對(duì)As的累積顯著增加.

c) 在聯(lián)合暴露條件下，As在生物解毒組分——HSP組分中占比顯著下降，說明nano-TiO2可能會(huì)抑制豐年蝦體內(nèi)As解毒過程，從而增強(qiáng)As的毒性效應(yīng).