明立亮,宋 勛,周思民
(1. 海南省萬(wàn)寧市人民醫(yī)院 藥劑科,海南 萬(wàn)寧 571500;2. 深圳大學(xué) 醫(yī)學(xué)部 藥學(xué)院,廣東 深圳 518000;3. 海南省人民醫(yī)院 藥學(xué)部,海南 海口 570177)
正柴胡飲顆粒是由柴胡、陳皮、防風(fēng)、甘草、赤芍和生姜6種藥材組成的復(fù)方制劑,具有發(fā)散風(fēng)寒,解熱止痛的功效,用于外感風(fēng)寒所致的發(fā)熱惡寒、無(wú)汗、頭痛、鼻塞、噴嚏、咽癢咳嗽、四肢酸痛;流感初起、輕度上呼吸道感染見(jiàn)上述證候者[1]。方中柴胡疏散退熱,疏肝解郁,升舉陽(yáng)氣,為君藥;防風(fēng)祛風(fēng)解表,勝濕止痛,生姜解表散寒,溫中止嘔,化痰止咳,共為臣藥;赤芍清熱涼血,散瘀止痛,陳皮理氣健脾,燥濕化痰,共為佐藥;甘草調(diào)和諸藥,為使藥。該制劑現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部,現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)芍藥苷進(jìn)行含量測(cè)定[1],現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)也僅針對(duì)其中 1~2 個(gè)成分進(jìn)行定量分析[2-5],不足以全面評(píng)價(jià)其內(nèi)在質(zhì)量。本研究首次建立了一種快速、高效、經(jīng)濟(jì)的多成分含量測(cè)定方法,同時(shí)測(cè)定正柴胡飲顆粒中 8個(gè)有效成分的含量。8個(gè)成分分別為柴胡的有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d[6-7]、陳皮的有效成分橙皮苷[8]、防風(fēng)的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷[9-10]、甘草的有效成分甘草苷和甘草酸銨[11]及赤芍有效成分芍藥苷[12]。該檢測(cè)方法具有速度快,效率高,溶劑消耗少,耐用性好,靈敏度高,穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)[13],可為進(jìn)一步提高正柴胡飲顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。
Waters ACQuity UPLC(美國(guó)Water公司);ABS-135S型電子天平(d=0.01 mg,瑞士梅特勒公司);FP240型鼓風(fēng)干燥箱(德國(guó)Binder公司);高效能超聲波清洗器(蘇州江東精密儀器有限公司)。
芍藥苷對(duì)照品(批號(hào):110736-202044,純度:96.8 %),甘草苷(批號(hào):111610-201607,純度:93.1 %),橙皮苷(批號(hào):110721-202019,純度:95.3 %),升麻素苷(批號(hào):111522-201913,純度:94.6 %),5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號(hào):111523-201811,純度:97.4 %),甘草酸銨 (批號(hào):110731-202021,純度:96.2 %),柴胡皂苷a(批號(hào):110777-201912,純度:94.8 %),柴胡皂苷d(批號(hào):110778-201912,純度:96.3 %,中國(guó)食品藥品檢定研究院);正柴胡飲顆粒6批,市售,批號(hào):200215,200324,200219,200517,200632,200703;規(guī)格:3 g/袋;甲醇,乙腈均為液相色譜純(Merck);乙醇(分析純,美國(guó)Fisher公司);其他試劑均為分析純,水為超純水。
色譜柱:Thermo Scientific AcclaimTMRSLC 120 C18(2.1 mm×100 mm,2.2 μm),流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1 %磷酸溶液(B),梯度洗脫(0~5 min,8 %A;5~10 min,8 %→15 %A; 10~15 min,15 %→30 %A;15~25 min,30 %→50 %A;25~30 min,50 %→60 %A;30~35 min,60 %→8 %A);流速:0.2 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):0~22 min,250 nm(檢測(cè)芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨),23~35 min,210 nm(檢測(cè)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d),柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:2.0 μl。
2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d適量,加70 %乙醇超聲溶解并定容,制成每1 ml分別含芍藥苷1428 μg、甘草苷106.1 μg、橙皮苷1728 μg、升麻素苷56.65 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷30.33 μg、甘草酸銨418.3 μg、柴胡皂苷a 72.25 μg和柴胡皂苷d 9.420 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,室溫避光保存,備用。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 ml,置10 ml量瓶中,用70 %乙醇溶液稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品溶液。
2.2.2 供試品溶液的制備 取正柴胡飲顆粒5袋混勻后,研細(xì),精密稱定1.0 g,置錐形瓶中,加70 %乙醇30 ml,精密稱定,超聲處理30 min(功率:250 W,頻率:40 kHz),取出放冷后,用70 %乙醇補(bǔ)足損失的重量,搖勻,室溫避光保存。
2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果色譜圖基線平穩(wěn),8個(gè)成分與相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5;理論塔板數(shù)按芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰計(jì)均大于8100。色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 UPLC圖譜
2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.3,0.5,1.0,2.0,3.0,5.0 ml,置10 ml量瓶中,加70 %乙醇溶液稀釋至刻度,搖勻,得系列混合對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度(x,μg/ml)對(duì)峰面積(y)進(jìn)行線性回歸,計(jì)算8個(gè)成分回歸方程和相關(guān)系數(shù),見(jiàn)表1。
表1 8個(gè)成分的回歸方程及線性范圍
2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖并計(jì)算8個(gè)成分峰面積的RSD。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積RSD(n=6)分別為0.48 %,0.69 %,0.85 %,0.96 %,1.02 %,0.67 %,0.89 %,0.74 %,表明精密度良好。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(批號(hào):200215)溶液,分別于0,2,6,10,16,24,36 h,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖并計(jì)算8個(gè)成分峰面積RSD。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d峰面積RSD(n=7)分別為0.78 %,0.69 %,1.21 %,0.69 %,0.71 %,0.82 %,0.97 %,0.58 %,表明供試品溶液36 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品(批號(hào):200215)均勻內(nèi)容物細(xì)粉6份,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖及峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算8個(gè)成分含量及其RSD值。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均含量分別為10.25,0.7541,12.36,0.4125,0.2121,2.896,0.5226,0.0668 mg/g,RSD(n=6)分別為0.54 %,1.02 %,0.49 %,0.88 %,0.63 %,0.45 %,0.74 %,1.21 %,表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量供試品(批號(hào):200215)均勻內(nèi)容物細(xì)粉6份,每份約0.5 g,精密稱定,分別加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3.5 ml,按2.2.2項(xiàng)下方法處理,按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,計(jì)算8個(gè)成分加樣回收率及相應(yīng)RSD值。結(jié)果芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d平均加樣回收率分別為98.30 %,98.75 %,98.49 %,98.71 %,98.47 %,98.75 %,98.57 %,98.42 %;RSD(n=6)分別為0.6 %,0.6 %,0.8 %,1.0 %,0.7 %,1.1 %,0.8 %,0.5 %。見(jiàn)表2。
表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
表2(續(xù))
2.4.1 色譜柱考察 精密稱取樣品(批號(hào):200215)適量,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別采用色譜柱Waters Symmetry C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)柱 、Waters C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)柱、Thermo Scientific AcclaimTMRSLC 120 C18(2.1 mm×100 mm,2.2 μm)柱,再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算8個(gè)成分含量,芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD(n=3)分別為0.57 %,0.63 %,0.95 %,0.77 %,0.57 %,0.39 %,0.43 %,0.82 %。結(jié)果表明,3種色譜柱均能滿足試驗(yàn)要求。
2.4.2 流速考察 精密稱取樣品(批號(hào):200215)適量,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,流速分別設(shè)置為0.8,1.0,1.2 ml/min,再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算8個(gè)成分的含量。芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD(n=3)分別為0.74 %,0.65 %,0.81 %,0.34 %,0.72 %,0.29 %,0.55 %,0.66 %,結(jié)果表明流速發(fā)生一定程度變化時(shí),仍能滿足試驗(yàn)要求。
2.4.3 柱溫考察 精密稱取樣品(批號(hào):200215)適量,按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 柱溫分別設(shè)置為 20,25,、30 ℃ ,再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積并計(jì)算8個(gè)成分的含量。芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量的RSD(n=3)分別為0.35 %,0.28 %,0.65 %,0.74 %,0.55 %,0.38 %,0.47 %,0.89 %,結(jié)果表明柱溫發(fā)生一定程度變化時(shí),仍能滿足試驗(yàn)要求。
綜上,本文建立的UPLC方法耐用性良好。
取6批供試品,按2.2.2項(xiàng)下方法處理,按2.1項(xiàng)下色譜條件平行進(jìn)樣3次,記錄色譜圖及相應(yīng)峰面積,按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算8個(gè)成分含量,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 8個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)
考察分別以乙腈、甲醇作為有機(jī)相,以不同濃度的磷酸(0.5 %,0.2 %,0.1 %)和甲酸(0.5 %,0.2 %,0.1 %)作為水相的分離效果,結(jié)果乙腈-0.1 %磷酸水溶液梯度洗脫時(shí)分離效果最佳,基線平穩(wěn),保留時(shí)間適中,各待測(cè)組分色譜峰峰型較好。
在190~400 nm波長(zhǎng)段分別掃描8個(gè)成分對(duì)照品溶液,結(jié)果芍藥苷在230 nm波長(zhǎng)處有較大吸收,甘草苷最大吸收波長(zhǎng)為237 nm,甘草酸銨最大吸收波長(zhǎng)為251 nm,橙皮苷最大吸收波長(zhǎng)為284 nm,升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,柴胡皂苷a和柴胡皂苷d在210 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用不同時(shí)段波長(zhǎng)切換法進(jìn)行檢測(cè),因過(guò)于頻繁的切換波長(zhǎng),基線發(fā)生漂移,造成基線不穩(wěn)定。最終確定0~22 min在250 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨6個(gè)成分,23~35 min在210 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 2個(gè)成分的含量。
預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了超聲和加熱回流兩種提取方式,結(jié)果顯示超聲提取較加熱回流提取各待測(cè)成分響應(yīng)值無(wú)明顯差異,但超聲提取較加熱回流操作簡(jiǎn)便,提取時(shí)間短,故最終選擇超聲法對(duì)樣品進(jìn)行處理??疾炝瞬煌瑵舛鹊募状肌⒁掖既芤旱奶崛⌒Ч?,結(jié)果顯示以70 %乙醇為溶劑提取時(shí)各成分提取率最高,且雜質(zhì)干擾少,色譜峰峰形良好。進(jìn)一步考察不同提取時(shí)間(20,30,40 min)對(duì)提取效果的影響,發(fā)現(xiàn)30 min 時(shí)各成分已基本提取完全。最終確定,最優(yōu)提取方法為70 %乙醇超聲提取30 min。
本文建立UPLC法同時(shí)測(cè)定正柴胡飲顆粒中芍藥苷、甘草苷、橙皮苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 8個(gè)成分含量,方法簡(jiǎn)便高效,快速準(zhǔn)確,可作為正柴胡飲顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效方法。