霍甜甜，李宜鮮

（河南省食品藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450009）

斑禿丸是由地黃、熟地黃、制何首烏、當(dāng)歸、丹參、炒白芍、五味子、羌活、木瓜九味藥物組成，具有補(bǔ)益肝腎、養(yǎng)血生發(fā)的功效，收載于《中國(guó)藥典》2020年版一部?！吨袊?guó)藥典》[1]中僅規(guī)定了2, 3, 5, 4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷）的定量測(cè)定方法，并在鑒別項(xiàng)下規(guī)定了當(dāng)歸、丹參、炒白芍和制何首烏的薄層色譜（TLC）質(zhì)量控制方法，其余藥材未見(jiàn)涉及。但TLC不能準(zhǔn)確定量，且實(shí)際操作過(guò)程較復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，受實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響較大。有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)該制劑白芍所含芍藥苷進(jìn)行定量研究[2]；對(duì)熟地黃、地黃所含主要成分梓醇、麥角甾苷、吉奧諾苷B1、馬替諾皂苷，制何首烏所含主要成分二苯乙烯苷、大黃素甲醚，白芍所含指標(biāo)性成分芍藥苷同時(shí)進(jìn)行定量測(cè)定研究[3]。前者測(cè)定成分較單一，后者僅控制地黃、熟地黃、制何首烏和炒白芍的組分含量，涵蓋的藥物組分較少。

多指標(biāo)成分測(cè)定能更好地從整體上控制中成藥的內(nèi)在質(zhì)量[4-10]，且盡量選取不同藥材中的組分進(jìn)行測(cè)定，可更加全面地反應(yīng)藥品質(zhì)量，以保證療效。在參考現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選取地黃和熟地黃中的毛蕊花糖苷[11-12]，制何首烏中的二苯乙烯苷和大黃素[13]，當(dāng)歸中的阿魏酸[14]，丹參中的丹參酮IIA和丹酚酸B[15]，炒白芍中芍藥苷[16]，五味子中的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素[17-18]，羌活中的異歐前胡素[19]作為斑禿丸的指標(biāo)性成分。采用高效液相色譜（HPLC）梯度洗脫，首次建立了HPLC同時(shí)測(cè)定斑禿丸中的芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素11種活性成分的測(cè)定方法，為更加全面地控制其內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，2998二極管陣列檢測(cè)器）；XP105電子天平（瑞士 Mettler 公司）；XMTD-204數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 （上海躍進(jìn)）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201943，含量95.1 %），毛蕊花糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111530-201512，供含量測(cè)定用），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201915，含量99.4 %），丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)：111562-201716，含量94.1 %），五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：110857-200507，供含量測(cè)定用），大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201913，含量96.0 %），異歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)：110827-201611，含量99.4 %），五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：0764-200005，供含量測(cè)定用），丹參酮IIA對(duì)照品（批號(hào)：110776-201721，含量99.5 %），五味子乙素對(duì)照品（批號(hào)：110765-200205，供含量測(cè)定用），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；二苯乙烯苷對(duì)照品（批號(hào)：16081510，HPLC純度≥98 %，成都普菲德）；斑禿丸（廣州白云山敬修堂藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：每10丸重1 g，批號(hào)分別為B08030，B06026，B06019，B12053，B04013，B04008，B01005）；甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，10 %A～15 %A；5～20 min，15 %A～55 %A；20～35 min，55 %A～75 %A；35～40 min，75 %A～80 %A；40～50 min，10 %A）；流量為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫為35 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別取芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA、五味子乙素的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，用50 %甲醇溶解，并配制成濃度分別為0.520，0.546，1.036，0.679，0.080，1.047，0.178，0.605，1.341，0.108，1.592 mg/ml的單標(biāo)貯備液。再依次取上述各貯備液適量，置于同一10 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液（芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA、五味子乙素的濃度分別為51.982，21.840，103.600，6.789，47.878，20.940， 7.127，18.160，6.705，3.248，7.960 μg/ml），備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取供試品30丸，研細(xì)混勻，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，密塞，搖散藥粉，稱(chēng)定重量，加熱回流提取1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用50 %甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按斑禿丸處方比例及工藝，分別制得缺地黃與熟地黃、制何首烏、當(dāng)歸、丹參、炒白芍、五味子、羌活的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μl，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，各成分色譜峰之間的分離度均大于1.5；在與上述11種對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的保留時(shí)間處，陰性樣品溶液沒(méi)有對(duì)應(yīng)的色譜峰，即陰性無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 斑禿丸中11種活性組分含量測(cè)定的HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，15，20，25，30 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖及峰面積。以進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，分別繪制各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自進(jìn)樣量范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，記錄芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的峰面積，測(cè)得11個(gè)組分峰面積的RSD值依次為1.46 %，0.57 %，0.28 %，0.66 %，0.91 %，0.74 %，1.49 %，2.01 %，0.84 %，0.35 %，1.52 %，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取丸劑（批號(hào)：B08030），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別于 0，4，8，12，18，24 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮ⅡA和五味子乙素峰面積的RSD依次為1.08 %，1.69 %，1.02 %，0.84 %，0.57 %，0.75 %，1.52 %，0.76 %，0.68 %，0.89 %，1.33 %，表明供試品溶液在制備后室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丸劑（批號(hào)：B08030），按2.2.2項(xiàng)下方法制備 6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得斑禿丸中芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的平均含量分別為1.790，0.397，2.364，0.146，3.942，0.642，0.198，0.487，0.111，0.116，0.188 mg/g，RSD依次為1.90 %，1.84 %，2.34 %，1.58 %，1.07 %，2.32 %，2.11 %，、0.86 %，1.36 %，1.44 %，2.47 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 取同一批各成分含有量已知的丸劑（批號(hào)：B08030），研細(xì)，分別取6份粉末，各約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入對(duì)照品溶液（含芍藥苷0.894 mg/ml、毛蕊花糖苷0.186 mg/ml、二苯乙烯苷1.173 mg/ml、阿魏酸0.074 mg/ml、丹酚酸B 2.088 mg/ml、五味子醇甲0.309 mg/ml、大黃素0.101 mg/ml、異歐前胡素0.240 mg/ml、五味子甲素0.052 mg/ml、丹參酮IIA 0.057 mg/ml、五味子乙素0.103 mg/ml）各1 ml，按 2.2.2項(xiàng)下方法制備加樣回收供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷、毛蕊花糖苷、二苯乙烯苷、阿魏酸、丹酚酸B、五味子醇甲、大黃素、異歐前胡素、五味子甲素、丹參酮IIA和五味子乙素的平均回收率分別為97.64 %，102.61 %，96.95 %，98.23 %，95.64 %，99.53 %，97.90 %，99.02 %，103.55 %，102.31 %，100.24 %，RSD分別為1.54 %，2.75 %，1.11 %，1.78 %，2.24 %，1.45 %，3.04 %，2.70 %，1.87 %，2.88 %，2.47 %（n=6）。

2.4 樣品含量測(cè)定

分別取7批斑禿丸，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 斑禿丸中11種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 梯度洗脫條件篩選

本試驗(yàn)首先考察了流動(dòng)相甲醇-水、乙腈-水[1]、乙腈-甲醇-水3種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)各成分的分離效果，結(jié)果乙腈-水系統(tǒng)對(duì)各成分的分離效果最好，各組分色譜峰間分離度均大于1.5；再考察了水、0.1 %磷酸溶液、0.2 %磷酸溶液和0.3 %磷酸溶液作為水相時(shí)對(duì)各色譜峰的影響，結(jié)果0.1 %～0.3 %磷酸溶液均能改善色譜峰的峰型，最終選擇乙腈-0.1 %磷酸溶液作為流動(dòng)相。試驗(yàn)過(guò)程中，嘗試通過(guò)增加流動(dòng)相中乙腈的比例，使各成分均能更早出峰，且各峰分離度均大于1.5，但在專(zhuān)屬性試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，部分成分的色譜峰受未知峰的干擾較大，專(zhuān)屬性不強(qiáng)；嘗試將圖1所示20 min后的目標(biāo)成分色譜峰出峰時(shí)間提前，結(jié)果7號(hào)和10號(hào)峰易受未知峰的干擾，無(wú)法達(dá)到基線分離。經(jīng)進(jìn)一步研究，采用2.1項(xiàng)下梯度洗脫條件時(shí)，各目標(biāo)峰峰型和分離度均良好，專(zhuān)屬性試驗(yàn)無(wú)干擾，因此選擇該條件作為最終的色譜條件。

3.2 提取方法的選擇

按回流提取法提取供試品，考察了提取時(shí)間為20，40，60 min時(shí)的各成分提取率，結(jié)果當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，各成分的提取率均能達(dá)到97 %以上，因此確定最佳提取時(shí)間為60 min。考察了水浴回流提取和超聲兩種提取方法，結(jié)果表明當(dāng)提取1 h時(shí)，水浴回流比超聲提取率高，因此采用回流提取法；考察以30 %甲醇、50 %甲醇、80 %甲醇和純甲醇作為提取溶劑時(shí)各成分的提取率，結(jié)果30 %甲醇提取的雜質(zhì)較多，綜合考慮各成分的提取率，選擇50 %甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

由于11種組分的最大吸收波長(zhǎng)各不相同，在試驗(yàn)初期嘗試選擇不同的吸收波長(zhǎng)分別測(cè)定各成分的含量，但使用不同波長(zhǎng)對(duì)儀器的要求較高，普通的紫外檢測(cè)器無(wú)法達(dá)到要求或需要不斷切換波長(zhǎng)。吸收波長(zhǎng)在220 nm和各成分的最大吸收波長(zhǎng)之間切換時(shí)，大多數(shù)組分峰面積變化不明顯，可滿(mǎn)足定量要求；影響較大的阿魏酸、二苯乙烯苷兩種組分，選擇220 nm和最大吸收波長(zhǎng)分別定量測(cè)定，結(jié)果不同波長(zhǎng)下測(cè)得的兩種組分含量差別不大，即均符合定量要求，最終選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上，本文建立HPLC法同時(shí)測(cè)定斑禿丸中11種活性組分含量的方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用性強(qiáng)，可為斑禿丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和完善，及臨床用藥提供可靠的質(zhì)量保證。