郭小藤,劉 燕,張清華,尚立霞
(山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東 濟(jì)南 250101)
黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵[Abelmoschus manihot(L.) Medic.]的干燥花冠(帶雄蕊及花柱),作為藥用始于宋代,其后歷代本草均有記載,多用其花入藥[1]。內(nèi)服主治五淋,水腫,具有清利濕熱、消炎解毒之功效;外用治療癰疽腫毒,湯水燙傷[2]。近年對黃蜀葵花的研究主要集中于化學(xué)成分及藥理藥效研究。現(xiàn)代化學(xué)研究表明,黃蜀葵花的主要活性成分是黃酮類成分,其中以金絲桃苷、異槲皮苷含量最高,具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、保護(hù)心腦缺血損傷、改善肝腎功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管新生、抗病毒等多種藥理活性[3-4]。
黃蜀葵原產(chǎn)我國南方,喜溫暖濕潤、雨量充沛、陽光充足的氣候及排水良好、疏松肥沃的土壤,對生境要求不嚴(yán),適應(yīng)性較強(qiáng)。目前除東北、西北等省外,全國大部分地區(qū)均有分布或栽培[5]。黃蜀葵花藥材品質(zhì)參差不齊,市售藥材大多為全帶花托或全不帶花托的藥材,其中約有50 %為碎花。植物不同部位中有效成分含量通常存在差異。本研究比較了黃蜀葵花及其花瓣、花托、碎花中總黃酮、金絲桃苷、異槲皮苷的含量,旨在為黃蜀葵花的質(zhì)量評價及綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
Waters e2695高效液相色譜儀(2998PDA二極管陣列檢測器,Waters Empower工作站,均為美國 Waters公司);Agilent 8454 UV-Vis分光光度計(美國安捷倫);Mettler XS-205電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多);KQ 2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
金絲桃苷對照品(批號:111521-201809,含量94.9 %,中國食品藥品檢定研究院);異槲皮苷對照品(批號:111809-201804,含量,97.2 %,中國食品藥品檢定研究院);黃蜀葵花藥材[產(chǎn)地為江蘇,經(jīng)山東省藥學(xué)科學(xué)院泰山學(xué)者重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.)Medic.的干燥花];乙腈為色譜純,磷酸為優(yōu)級純,其他試劑均為分析純,水為超純水。
本試驗(yàn)選用的藥材為江蘇種植的全帶花托和全無花托的樣品,詳見表1。
表1 黃蜀葵花藥材來源
每批藥材分別取樣200 g,從樣品中隨機(jī)選取100朵帶托花或不帶托花,分別稱重。將帶托花摘分為花托和花瓣(包括花蕊),分別稱重,從剩余樣品中篩選出長度大于1.5 cm的花,剩余小于1.5 cm的為碎花,稱定碎花重量,計算不同部位占總重的比例,結(jié)果見表2,不同部位圖片見圖1。
表2 黃蜀葵花不同部位重量占比
圖1 黃蜀葵花藥材不同部位樣品
2.2.1 供試品溶液的制備 取2.1項(xiàng)下不同批次不同部位的黃蜀葵花藥材樣品各約10 g,粉碎,過四號篩,分別取樣品粉末0.5 g,各2份,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入甲醇100 ml,稱定重量,加熱回流2 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,備用。
2.2.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷80 μg的溶液,即得。
2.2.3 測定波長的選擇 精密量取對照品溶液3 ml,置25 ml量瓶中,加50 %甲醇稀釋至刻度,搖勻;精密量取供試品溶液1 ml,置25 ml量瓶中,加50 %甲醇稀釋至刻度,搖勻。以50 %甲醇為空白,在200~800 nm范圍內(nèi)掃描,結(jié)果金絲桃苷對照品與黃蜀葵花藥材供試品溶液在256 nm波長處均有最大吸收,因此將檢測波長確定為256 nm,光譜圖見圖2。
圖2 黃蜀葵花紫外-可見吸收光譜
2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對照品溶液1,2,3,4,5,6 ml,分別置25 ml量瓶中,加50 %甲醇稀釋至刻度,搖勻。以50 %甲醇為空白,照紫外-可見分光光度法在256 nm波長處測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:A=0.0531C-0.0050(R2=0.99994),線性范圍為3.0596~18.3570 μg/ml。
2.2.5 樣品中總黃酮的含量測定 精密量取供試品溶液1.0 ml,置25 ml量瓶中,加50 %甲醇稀釋至刻度,搖勻,在256 nm處測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中金絲桃苷的濃度,計算總黃酮含量。結(jié)果見表3。
表3 黃蜀葵花不同部位總黃酮含量測定結(jié)果(n=2)
黃蜀葵花全花樣品總黃酮含量為3.92 %~6.73 %,碎花樣品總黃酮含量為7.71 %~8.92 %,花瓣樣品總黃酮含量為5.72 %~7.12 %,花托樣品總黃酮含量為1.74 %~1.79 %。不同部位總黃酮含量的高低順序?yàn)樗榛ǎ净ò辏净ㄍ小?/p>
2.3.1 色譜條件 Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:乙腈-0.1 %磷酸溶液(15:85),流速 1.0 ml/min,檢測波長:360 nm,進(jìn)樣量:10 μl,柱溫:35 ℃。
2.3.2 混合對照品溶液的制備 取金絲桃苷和異槲皮苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷100 μg、異槲皮苷60 μg的混合溶液,即得。
2.3.3 供試品溶液的制備 取2.2.1項(xiàng)下黃蜀葵花藥材樣品粉末0.2 g,各2份,精密稱定,置25 ml量瓶中,加入甲醇15 ml超聲處理(功率100 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液。
2.3.4 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖3。供試品溶液的色譜圖中,在與對照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上,有相同保留時間的色譜峰,且金絲桃苷峰、異槲皮苷峰與相鄰峰之間的分離度均符合要求。
圖3 黃蜀葵花藥材HPLC圖譜
2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取金絲桃苷對照品4.92 mg,異槲皮苷2.40 mg,置10 ml量瓶中,加甲醇適量,超聲使溶解,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品貯備液,精密量取貯備液0.1,0.2,0.4,0.8,1.0,1.5,2.0 ml,分別置5 ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為線性對照品溶液;分別精密吸取上述線性對照品溶液及貯備液各10 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖及峰面積,分別以峰面積(A)為縱坐標(biāo),金絲桃苷、異槲皮苷濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程。金絲桃苷、異槲皮苷的回歸方程分別為A=22 260.15C-43 397.18,A=21 460.69C-25 103.23;相關(guān)系數(shù)r分別為0.99997,0.99995。結(jié)果表明,金絲桃苷濃度在9.84~492.00 μg/ml、異槲皮苷濃度4.72~236.00 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。
2.3.6 精密度試驗(yàn) 取線性對照品溶液(含金絲桃苷98.40 μg/ml,異槲皮苷47.20 μg/ml),連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。計算金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.21 %,0.35 %(n=6),表明儀器精密度良好。
2.3.7 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取線性對照品溶液(含金絲桃苷98.40 μg/ml,異槲皮苷47.20 μg/ml)及供試品溶液,分別于0,2,4,8,12,18,24 h精密吸取各10 μl進(jìn)樣測定,記錄峰面積。結(jié)果,對照品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.27 %,0.72 %(n=6),供試品溶液中金絲桃苷、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.32 %,0.64 %(n=6),表明對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)均穩(wěn)定。
2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取黃蜀葵花供試品粉末6份,每份0.2 g,按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定供試品中金絲桃苷、異槲皮苷的含量。結(jié)果,金絲桃苷、異槲皮苷的平均含量分別為0.658 %,0.316 %,RSD分別為0.93 %,1.11 %(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。
2.3.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的黃蜀葵花供試品粉末(金絲桃苷含量為0.658 %,異槲皮苷含量為0.316 %)62.4,78,93.6 mg,各3份,精密稱定,分別置于25 ml量瓶中,分別精密加入對照品溶液(含金絲桃苷0.502 mg/ml、異槲皮苷0.264 mg/ml)1.2,1.0,0.8 ml,按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積,計算各成分的加樣回收率及RSD。結(jié)果,金絲桃苷、異槲皮苷的平均回收率分別為98.89 %和100.95 %,RSD分別為0.91 %和0.96 %,表明該方法準(zhǔn)確度較好。
2.3.10 樣品含量測定 分別取黃蜀葵花不同部位藥材粉末,按2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測定,按外標(biāo)法以峰面積計算金絲桃苷、異槲皮苷含量。結(jié)果見表4。
表4 黃蜀葵花不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量測定結(jié)果(n=2)
黃蜀葵花全花樣品金絲桃苷含量為0.658 %~1.296 %,異槲皮苷含量為0.316 %~0.790 %;碎花樣品金絲桃苷含量為1.345 %~1.550 %,異槲皮苷含量為0.756 %~1.111 %;花瓣樣品金絲桃苷含量為1.018 %~1.370 %,異槲皮苷含量為0.537 %~0.688 %;花托樣品金絲桃苷含量為0.151 %~0.163 %,異槲皮苷含量為0.039 %~0.041 %。不同部位金絲桃苷、異槲皮苷含量的高低順序?yàn)樗榛ǎ净ò辏净ㄍ小?/p>
采用SPSS 22.0分析軟件對黃蜀葵花不同部位的各成分含量進(jìn)行方差分析和LSD多重比較,結(jié)果見表5、表6。
表5 黃蜀葵花不同部位各成分含量方差分析結(jié)果
表6 黃蜀葵花不同部位各成分含量多重比較結(jié)果
表6(續(xù))
方差分析結(jié)果顯示,P<0.05,說明黃蜀葵花不同部位中相應(yīng)成分的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。通過LSD多重比較可知,全帶托的黃蜀葵花、碎花、花瓣中相應(yīng)成分的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義,全無托的黃蜀葵花、碎花、花瓣兩兩之間總黃酮的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義,全無托的碎花與花瓣中金絲桃苷的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義,全無托的碎花與全花、碎花與花瓣中異槲皮苷的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
近年,關(guān)于黃蜀葵花中黃酮類化合物的研究較多,但黃蜀葵花不同部位黃酮類化合物的含量比較尚未見報道。本試驗(yàn)比較了黃蜀葵花、花瓣、花托、碎花中的黃酮類成分含量,采用SPSS軟件對測定結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果顯示:①黃蜀葵花不同部位均含總黃酮、金絲桃苷和異槲皮苷,各成分在不同部位的含量分布不同,碎花>花瓣>花托,不同部位間各成分含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②花托重量占全花重量比例約為42 %,但其有效成分含量較低,金絲桃苷含量約為全花的20 %,異槲皮苷約為11 %。按中國藥典規(guī)定,黃蜀葵花藥材應(yīng)為錦葵科植物黃蜀葵的干燥花冠[6],而市售藥材多為帶花托的整花,與藥典中的藥用部位不一致。增加的花托部分降低了藥材的質(zhì)量,在藥品研發(fā)及生產(chǎn)時需手工將花托摘去,操作無法實(shí)現(xiàn)規(guī)范統(tǒng)一,同時也增加了前處理工序和生產(chǎn)成本,不利于黃蜀葵花藥材的開發(fā)利用。③碎花的各成分含量均較高,分析原因?yàn)樗榛ㄝp薄,相同重量下純花瓣數(shù)量更多。由于全無托的花經(jīng)干燥后易分散,如果經(jīng)過反復(fù)分裝、運(yùn)輸易破碎并產(chǎn)生較多碎花,且在市場流通環(huán)節(jié)中,碎花極易損失,致使藥材中含量較高的部位流失,影響黃蜀葵花藥材的療效。
由結(jié)果可見,黃蜀葵花在種植、采收、加工、貯藏及運(yùn)輸過程均會使不同批次藥材的外觀性狀產(chǎn)生較大差異,從而影響黃蜀葵花有效成分的含量。隨著市場對黃蜀葵花藥材需求的逐年增加,全國各地建立了多處種植基地,種植面積及產(chǎn)量也逐年增加,本研究結(jié)果表明,需對藥材的整個生產(chǎn)加工過程進(jìn)行更規(guī)范化、嚴(yán)格化的管理,如在采摘時注意去掉含量較低的花托;再如碎花中的各成分含量均較高,在干燥過程中需嚴(yán)格控制藥材厚度、干燥時間、干燥溫度等參數(shù),按中國藥典控制藥材水分低于12 %的同時,盡可能避免過度干燥,以減少碎花的破碎,同時應(yīng)避免反復(fù)分裝,減少在包裝運(yùn)輸過程中碎花的產(chǎn)生,以保證藥材的質(zhì)量。
本研究采用紫外可見分光光度法測定黃蜀葵花中總黃酮含量[7],采用HPLC同時測定金絲桃苷和異槲皮苷的含量[6],方法準(zhǔn)確度、靈敏度高,重現(xiàn)性好,所得數(shù)據(jù)可靠。本研究不僅對黃蜀葵花藥材不同部位的總黃酮量進(jìn)行了測定,同時對總黃酮中含量及活性最高的指標(biāo)成分金絲桃苷、異槲皮苷進(jìn)行了定量分析,揭示了黃蜀葵花藥材中總黃酮與單成分含量之間的關(guān)系,更全面地評價了黃蜀葵花藥材的質(zhì)量,可為進(jìn)一步研究有效部位與單成分之間的相關(guān)性和藥效機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。