劉文凱，田 玲，喬自林，李 鈾，王家敏，王明明

（1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學工程學院，甘肅 蘭州 730030）

各國特有的物種基因資源，早就成為世界關(guān)注和爭奪的焦點，許多國家己經(jīng)將基因資源庫的建設列為未來社會可持續(xù)發(fā)展以及打贏未來經(jīng)濟戰(zhàn)的戰(zhàn)略建設工程。藏獒原產(chǎn)于青藏高原，分布于海拔3 000～5 000 km的嚴寒地帶，屬于國家二級保護動物[1]。極端惡劣的生活環(huán)境造就了藏獒特殊的身體構(gòu)造和生理特性[2]。這是藏獒可以在惡劣生存環(huán)境中維持協(xié)調(diào)統(tǒng)一性狀并匹配環(huán)境多樣性的主要原因[3]。目前，對藏獒的研究多集中于培育養(yǎng)殖、品種鑒定等方面，細胞、分子水平的研究相對較少[4]。

近年來，為了了解細胞增殖與衰老的分子機制，為治療腫瘤、控制腫瘤細胞增殖以及器官移植等奠定基礎，或使傳代困難、增殖慢、易衰老的細胞獲得永生，獲得更多的細胞資源，細胞永生化研究成為熱點。細胞永生化（cell immortalization）指體外培養(yǎng)的細胞經(jīng)過自發(fā)的或受外界因素的影響從增殖衰老危機中逃離, 從而具有無限增殖能力的過程。通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等，導入目的細胞內(nèi), 以增加永生化的發(fā)生率, 進而建立永生化細胞株（immortalized cell strains），以達到使體外培養(yǎng)的細胞具有無限增殖能力且細胞間無差異的目的[5]。

染色體的數(shù)目與核型是細胞穩(wěn)定傳代的關(guān)鍵，是能夠用來鑒別細胞種類特征的關(guān)鍵標準[6]。病毒介導方式的永生化可能會使細胞的染色體數(shù)目發(fā)生缺失或增加。因此，對細胞進行染色體分析也是確定其穩(wěn)定傳代的因素之一。

該研究利用實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞，探討了其體外培養(yǎng)的形態(tài)特征、傳代次數(shù)、凍存復蘇、生長特性、細胞核型以及G418最低致死濃度，為藏獒腎臟細胞永生化的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年2—6月在西北民族大學生物工程細胞中心實驗室進行。以實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞為材料，采用10%胎牛血清配置的細胞培養(yǎng)液在T25細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 原代細胞傳代按照細胞生長情況及時更換新鮮細胞培養(yǎng)液進行傳代培養(yǎng)，等細胞生長密度達85%～90%以上時按照1∶3的比例進行傳代培養(yǎng)，適時觀察拍照，并記錄細胞生長狀態(tài)，著重記錄F2、F5、F10代細胞狀態(tài)。

1.2.2 細胞凍存與復蘇把凍存管放在37℃的水浴中快速搖動，在90 s內(nèi)搖動至融化，混勻離心后放入T25細胞培養(yǎng)瓶加入新鮮培養(yǎng)基，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，至細胞生長密度達到85%～90%時，加入胰酶進行消化，然后離心保留細胞，加入細胞凍存液，按照4℃10 min、-20℃30 min、-80℃過夜、液氮永久保存的順序緩慢凍存。

1.2.3 細胞生長特性觀察將F3代、F5代、F10代細胞分別接種至六孔板中，待生長密度達70%～80%時，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征，對比細胞傳代前后的差異，并拍照記錄。

1.2.4 復蘇細胞活率測定取3只凍存后的F4代細胞，用臺盼藍染色法，將待檢細胞復蘇后制成細胞懸液，按1∶1比例混勻，加入細胞計數(shù)板中，活細胞細胞結(jié)構(gòu)完整，透明無色，死細胞均為藍色。每只凍存管計數(shù)3次，加入細胞計數(shù)板后，利用細胞計數(shù)儀計算活率，即為細胞活力。

1.2.5 細胞生長曲線繪制取2瓶生長密度至85%的F3代細胞按照1×104個/孔加入24孔細胞培養(yǎng)板孔中，每日更換培養(yǎng)液，進行細胞計數(shù)，取3個平行樣的均值，以培養(yǎng)時間作為橫坐標，以細胞密度作為縱坐標，利用prism軟件，繪制細胞生長曲線。

1.2.6 G418最低致死濃度篩選取生長狀態(tài)良好F3代細胞，在24孔培養(yǎng)板中按照1×104個/孔的標準，當細胞鋪展率約為50%～60%時加入含有不同濃度G418的篩選培養(yǎng)基，G418濃度區(qū)間為0～1 000 μg/mL，以100 μg/mL為一個梯度配置11個不同的篩選濃度。每2 d更換篩選培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并記錄細胞生長狀況，第14天能夠殺死所有細胞的最小G418濃度即為最低致死濃度。

1.2.7 核型分析將形態(tài)與生長狀態(tài)良好的F3代細胞接種至6孔培養(yǎng)板，加入秋水仙素溶液處理6 h；經(jīng)過胰酶消化后，加入預熱的氯化鉀吹打，置于37℃培養(yǎng)箱靜置30 min；棄去氯化鉀，加入固定液，1 500 r/min離心5 min；反復3次后吸取重懸液從50 cm高處滴至玻片上，立刻在酒精燈上過3～5個來回，風干30 min；用10%的Giemsa染液染色20 min后，在蒸餾水下進行沖洗，之后在倒置顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學觀察

通過傳代培養(yǎng)，每代細胞按照1∶3比例進行傳代，保證每代細胞最少有5瓶，并對生長良好的F2、F3、F5、F8代細胞進行凍存。觀察發(fā)現(xiàn)，細胞形態(tài)均為成纖維細胞，形狀梭形（圖1），呈放射狀與旋渦狀樣式生長，經(jīng)過復蘇后形態(tài)與長勢均呈現(xiàn)良好狀態(tài)。觀察還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代至F5代，細胞增殖較快，呈放射狀生長，細胞呈梭形，長勢良好；F5代至F8代，細胞增殖減弱甚至停滯，細胞呈多邊形狀態(tài)，出現(xiàn)細胞脫落現(xiàn)象，最終于F8代無法繼續(xù)生長。

圖1 F3、F5、F8代藏獒腎臟細胞的生長狀態(tài)比較

2.2 復蘇細胞活率測定

藏獒細胞凍存前平均活力為 97%，凍存2個月后取3支細胞進行復蘇，測出的平均活力為 91%。

2.3 細胞生長曲線繪制

如圖2所示，藏獒組織細胞生長狀況較好，生長曲線呈“S”型，細胞生長均符合體外細胞生長規(guī)律。按照細胞群體倍增時間的公式：PDT=t×lg2/(lgNtlgN0)。其中，t表示培養(yǎng)時間，N0表示第一次所得的細胞數(shù)目，Nt代表示培養(yǎng)t時間后的細胞數(shù)目。由此可得細胞的倍增時間為27 h。

圖2 F3代藏獒腎臟細胞的生長曲線

2.4 G418最低致死濃度篩選

為了后續(xù)永生化試驗陽性細胞的篩選，在培養(yǎng)液中分別添加0～1 000 μg/mL的G418， 每100 μg設置1個梯度，培養(yǎng)F3代藏獒腎臟細胞14 d，結(jié)果表明，500 μg/mL濃度組及更大濃度組的細胞在第14 天全部死亡，表明500 μg/mL可作為G418篩選藏獒腎臟細胞的最低致死濃度（圖3）。

圖3 不同濃度的G418處理對F3代藏獒腎臟細胞的影響

2.5 核型分析

由圖4可知，正常的藏獒腎臟細胞染色體數(shù)目為2n=78，包括38對常染色體和1對性染色體。

圖4 正常藏獒腎臟細胞的染色體

3 討 論

犬這個物種的起源一直是生物界關(guān)注的熱點，經(jīng)過多方論證，目前學界已有共同認知，即：所有家犬均來自于灰狼[7]。目前，有對牧羊犬、阿拉斯加等犬的細胞進行體外培養(yǎng)，但藏獒細胞體外培養(yǎng)相關(guān)案例較少[8]。動物體細胞的體外培養(yǎng)會受到許多因素的影響，如培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)方法等。細胞的染色體改變也會對增殖能力產(chǎn)生巨大影響[9]。細胞生長曲線能夠較好地展示細胞數(shù)目的改變，在細胞生長過程中也可通過糖耗來反映細胞的活力，從而明確細胞的狀態(tài)[10]。

該研究表明，藏獒腎臟細胞體外培養(yǎng)時形態(tài)均為成纖維細胞，形狀梭形，呈放射狀與旋渦狀樣式生長，經(jīng)過復蘇后形態(tài)與長勢均呈現(xiàn)良好狀態(tài)；F1代至F5代，細胞增殖較快，呈放射狀生長，細胞呈梭形，長勢良好；F5代至F8代，細胞增殖減弱甚至停滯，細胞呈多邊形狀態(tài)，出現(xiàn)細胞脫落現(xiàn)象，最終于F8代無法繼續(xù)生長；生長曲線測定結(jié)果顯示，24孔板內(nèi)細胞數(shù)目最高值達到4.06×105個/mL，最短倍增時間為27 h，說明細胞生長速度較快。

動物體細胞在體外培養(yǎng)的條件下，隨著傳代數(shù)目的增多，染色體數(shù)目可能發(fā)生變化[11]。體細胞染色體的倍增數(shù)目與動物細胞的培養(yǎng)方式有關(guān)[12]。藏獒成纖維細胞的染色體研究，對藏獒的分類和繁衍有重大參考價值。根據(jù)圖像軟件排序，可展示藏獒細胞染色體的數(shù)目和形態(tài)特征[13]。但是，藏獒細胞染色體的玻片標本還具有無法輕易看出的染色體，目前在技術(shù)上還存在一些難點，無法進行深入研究，后續(xù)可通過熒光探針等方法進行深入探索[14]。

G418是一種糖類抗生素，與卡那霉素、氨芐霉素的構(gòu)造相近，可通過對80S核糖體的調(diào)控而阻止蛋白質(zhì)的生成，對細胞具有毒性，是篩選穩(wěn)定細胞系最常用的試劑[15]。帶有neo基因的細胞通過轉(zhuǎn)染具有免疫后，能夠抵抗帶有G418的篩選培養(yǎng)基[16]。目前，G418的這種功能在基因敲除、基因過表達等領(lǐng)域有較高的應用價值[17]。結(jié)果顯示，500 μg/mL及以上濃度的G418處理組，藏獒細胞在培養(yǎng)第14天即全部死亡，表明500 μg/mL可作為G418篩選藏獒腎臟細胞的最低致死濃度。

實驗室前期采用組織塊法構(gòu)建了藏獒腎臟組織細胞系，細胞凍存代次均在3代以內(nèi)，形態(tài)較好。復蘇后細胞活力均保持在90%以上。該研究利用實驗室前期自主分離的藏獒腎臟細胞，探討了其體外培養(yǎng)的形態(tài)特征、傳代次數(shù)、凍存復蘇、生長特性、細胞核型以及G418最低致死濃度，明確了藏獒腎臟細胞自發(fā)傳代的最終代次，發(fā)現(xiàn)了自發(fā)傳代中存在的問題，為后續(xù)的病毒感染篩選打下了基礎，同時也為進一步研究藏獒細胞的生物學特性奠定了基礎。