劉倩梅,柯 敏,何馨媛,景作磊,劉 平

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物化學(xué)與生物制品研究所,江蘇 南京 210023)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性中最常見的非皮膚型惡性腫瘤[1],嚴(yán)重威脅男性生命健康. 據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計,前列腺癌已經(jīng)成為導(dǎo)致美國男性癌癥死亡的第二大病因[2]. 就中國癌癥情況分析,2020年前列腺癌新發(fā)病例12萬,雖明顯低于歐美國家,但隨著高齡人口的增多、生活和飲食習(xí)慣的改變,前列腺癌發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢[3].

NCAPD3定位于11q25,包含37個外顯子序列,全長共1 498個氨基酸,有4個HEAT重復(fù)結(jié)構(gòu)域和一個coiled-coil結(jié)構(gòu)域[4],是凝縮蛋白復(fù)合物II(Condensin II)的非SMC調(diào)節(jié)亞基之一,在細(xì)胞有絲分裂過程中扮演了重要的角色,主要負(fù)責(zé)染色體的凝縮和分離. NCAPD3的功能異常可能導(dǎo)致染色體凝縮中斷,并導(dǎo)致分離錯誤. 研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)NCAPD3缺失后,細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)和大小都會發(fā)生很大改變[5];果蠅中NCAPD3發(fā)生突變,會導(dǎo)致染色體凝縮和分離存在缺陷[6],不能形成離散的染色體區(qū)域[7]. 此外,NCAPD3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān). 有報道稱,NCAPD3的表達與前列腺癌根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān),與腫瘤病理分期、Gleason分級和術(shù)前PSA水平無關(guān),提示NCAPD3是一個新的前列腺癌預(yù)后因子[8].

EZH2是多梳蛋白抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2,PRC2)的核心成員,其生物學(xué)功能主要是抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄. 具體機制主要包括以下兩種:第一種是EZH2發(fā)揮H3K27甲基轉(zhuǎn)移酶活性[9],第二種是EZH2與表觀遺傳修飾酶合作[10]. 研究表明,EZH2在多種惡性腫瘤中均高表達,典型的有前列腺癌、乳腺癌、胃癌等. Matsika等通過免疫組化對前列腺癌組織中的EZH2進行了染色,發(fā)現(xiàn)EZH2的表達與分化指數(shù)和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)[11];EZH2可以促進前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,且激素非依賴型前列腺癌中的EZH2蛋白的表達要高于激素依賴型[12],因此EZH2可以作為前列腺癌診斷和預(yù)后的指標(biāo)以及一個新的治療靶點. 有關(guān)NCAPD3與EZH2的關(guān)系仍未見報道,本研究旨在探討前列腺癌中NCAPD3對EZH2的影響.

1 材料方法

1.1 材料

RPMI 1640培養(yǎng)基購自維森特生物技術(shù)(南京)有限公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;胰蛋白酶(Trypsin)購自索萊寶生物科技公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司;免疫組化試劑盒購自博士得生物科技公司;預(yù)染蛋白Marker購自Themo Fisher公司;Trizol、Lipofectmine 2000購自美國Invitrogen公司;HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)、SYBRE? Premix Ex Taq TM購自南京諾唯贊生物有限公司;NCAPD3、STAT3、EZH2抗體購自Proteintech公司;β-actin、AR抗體、Cy3 標(biāo)記的熒光二抗、FITC標(biāo)記的熒光二抗購自ABclonal公司;Enzalutamide購自Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 臨床樣本和細(xì)胞系

收集江蘇省中醫(yī)院行機器人輔助腹腔鏡前列腺癌切除術(shù)的前列腺癌組織及癌旁組織,所有患者均提供書面知情同意書. 正常前列腺上皮細(xì)胞WPMY-1、良性增生前列腺細(xì)胞BPH-1以及4種前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、CWR22Rv1、LNCaP購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基,放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 細(xì)胞傳代時使用0.25%的胰蛋白酶消化,3 d～4 d傳代一次.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞消化后計數(shù)種板,待細(xì)胞長至密度為70%左右時,按質(zhì)粒:lipofectmine 2000=2 μg:3 μL的比例進行轉(zhuǎn)染. 用RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別稀釋轉(zhuǎn)染試劑lipofectmine 2000和質(zhì)粒DNA,輕輕混勻后靜置 5 min,然后將稀釋后的質(zhì)粒加入到稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑中,再次輕輕混勻,靜置18 min,將上述混合物均勻滴加在含RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞中,培養(yǎng)箱中孵育6 h左右,更換為含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h.

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blotting)實驗

按照RIPA:PMSF:cocktail=9∶1∶0.1的比例配制蛋白裂解液,將蛋白裂解液加入到細(xì)胞沉淀中,置于冰上放置40 min,每隔10 min渦旋一次,以充分裂解細(xì)胞. 12 000 rpm,4 ℃離心18 min,吸取上清,所得即為蛋白. 用DC法對蛋白進行定量,取20 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳. 電泳結(jié)束后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉90 min;封閉完成后用1×PBST清洗3次,一抗4 ℃孵育過夜. 第二天用1×PBST清洗3次后,二抗室溫孵育90 min,最后將ECL顯影液滴加在PVDF膜上,置于化學(xué)發(fā)光顯影儀中拍照.

1.2.5 RNA提取和實時定量PCR實驗

用Trizol提取細(xì)胞的總RNA,用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA,使用StepOne Plus系統(tǒng)和SYBR green染料進行實時定量PCR(qRT-PCR),檢測目的基因的mRNA表達水平.

1.2.6 免疫組化(Immunohistochemical)實驗

腫瘤組織離體后盡快放入4%多聚甲醛中固定過夜,經(jīng)梯度脫水后進行石蠟包埋和切片;切片依次進行二甲苯脫蠟、梯度酒精復(fù)水、通透及封閉內(nèi)源性過氧化物酶、微波高溫抗原修復(fù)、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、中性樹脂封片,晾干;最后用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照.

1.2.7 免疫熒光(Immunofluorescence)實驗

將細(xì)胞計數(shù)后接種到12孔板中,1×105個/孔;轉(zhuǎn)染處理48 h后,用4%的多聚甲醛固定30 min,0.1% Triton X-100室溫通透25 min,3% BSA室溫封閉30 min,4 ℃過夜孵育一抗;PBS洗3次,37 ℃避光孵育熒光二抗1 h,避光孵育DAPI 5 min染核,熒光顯微鏡下觀察并拍照.

1.2.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,使用ttest分析實驗數(shù)據(jù),通過(Mean±SEM)來表示.P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義,用*表示;P<0.01表示差異顯著,用**表示;P<0.001表示差異極顯著,用 *** 表示. 使用GraphPad Prism 6.0和PhotoShop軟件作圖.

A:GEPIA網(wǎng)站分析前列腺腫瘤組織與正常組織中NCAPD3水平;B:GEPIA網(wǎng)站分析前列腺腫瘤組織與正常組織中EZH2水平;C:ASSISTANT for Clinical Bioinformatics網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫中前列腺腫瘤組織與正常組織中NCAPD3水平;D:ASSISTANT for Clinical Bioinformatics網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫中前列腺腫瘤組織與正常組織中EZH2水平.圖1 NCAPD3和EZH2在前列腺癌組織中高表達Fig.1 NCAPD3 and EZH2 are highly expressed in prostate cancer tissues

2 結(jié)果與討論

2.1 NCAPD3和EZH2在前列腺癌組織中高表達

利用GEPIA網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析前列腺腫瘤組織與正常組織中NCAPD3與EZH2的表達情況,發(fā)現(xiàn)NCAPD3與EZH2在前列腺癌組織中的表達水平都明顯高于鄰近正常組織(如圖1 A,B所示). 利用ASSISTANT for Clinical Bioinformatics網(wǎng)站(https://www.aclbi.com/static/index.html#/)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫前列腺腫瘤組織與正常組織中NCAPD3與EZH2的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCAPD3與EZH2在前列腺癌組織中的表達水平都明顯高于鄰近正常組織(如圖1 C,D所示),進一步驗證上述結(jié)果. 綜上,NCAPD3和EZH2在前列腺癌組織中高表達.

2.2 NCAPD3和EZH2在前列腺癌細(xì)胞和臨床組織樣本中高表達

通過數(shù)據(jù)庫分析,發(fā)現(xiàn)NCAPD3和EZH2在前列腺癌組織中高表達,因此,進一步在細(xì)胞水平和臨床組織水平進行驗證. 提取正常前列腺上皮細(xì)胞WPMY-1、良性增生前列腺細(xì)胞BPH-1以及4種前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、CWR22Rv1、LNCaP的蛋白,采用Western blot實驗檢測NCAPD3和EZH2在以上6種細(xì)胞系中的表達情況. 結(jié)果表明,NCAPD3和EZH2的蛋白水平在WPMY-1和BPH-1中較低,在4種前列腺癌細(xì)胞系中高表達(如圖1 A,B,C所示). 提取上述6種細(xì)胞的RNA,采用RT-PCR實驗檢測NCAPD3和EZH2在以上6種細(xì)胞系中的mRNA水平,結(jié)果與蛋白水平一致(如圖1 D所示). 收集前列腺癌組織及鄰近正常組織,通過免疫組化檢測NCAPD3和EZH2在前列腺癌臨床樣本中的表達情況,結(jié)果顯示,NCAPD3和EZH2在前列腺癌組織中的染色強度均明顯高于鄰近正常組織(如圖1 E,F所示). 綜上,得出結(jié)論:NCAPD3和EZH2在前列腺癌細(xì)胞和臨床組織樣本中均高表達,提示兩者存在一定的相關(guān)性.

A:Western blot檢測NCAPD3和EZH2在正常前列腺上皮細(xì)胞系、良性增生前列腺細(xì)胞系和4種前列腺癌細(xì)胞系中的表達情況;B:對圖A中NCAPD3的量化分析圖;C:對圖B中EZH2的量化分析圖;D:RT-PCR檢測NCAPD3和EZH2在正常前列腺上皮細(xì)胞系、良性增生前列腺細(xì)胞系和4種前列腺癌細(xì)胞系中的表達情況;E:免疫組化檢測NCAPD3在前列腺癌組織和鄰近正常組織中的表達情況;F:免疫組化檢測EZH2在前列腺癌組織和鄰近正常組織中的表達情況.圖2 NCAPD3和EZH2在前列腺癌細(xì)胞和臨床組織樣本中高表達Fig.2 NCAPD3 and EZH2 are highly expressed in prostate cancer cells and clinical tissues

2.3 NCAPD3可以調(diào)節(jié)EZH2的表達

為了探究NCAPD3是否可以調(diào)節(jié)EZH2的表達,在PC-3及DU145細(xì)胞中過表達NCAPD3,檢測EZH2蛋白水平變化情況. 結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達NCAPD3后,EZH2的蛋白水平明顯上調(diào)(如圖3 A所示). 為了進一步驗證,在CWR22Rv1及LNCaP細(xì)胞中敲低NCAPD3,檢測EZH2蛋白水平變化情況. 結(jié)果發(fā)現(xiàn):敲低NCAPD3后,EZH2的蛋白水平明顯下調(diào)(如圖3 B所示). 在PC-3或CW22Rv1細(xì)胞中分別過表達或敲低NCAPD3,通過RT-PCR檢測EZH2 mRNA水平變化情況. 結(jié)果顯示:過表達NCAPD3后EZH2的 mRNA 水平升高,敲低NCAPD3后EZH2的mRNA水平降低(如圖3 C所示),表明NCAPD3可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)EZH2的表達. 免疫熒光實驗結(jié)果表明,在PC-3細(xì)胞中過表達NCAPD3后,EZH2的熒光強度明顯變強,而在CW22Rv1中敲低NCAPD3后,EZH2的熒光強度變?nèi)?如圖3 D所示). 綜上,發(fā)現(xiàn)NCAPD3可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)EZH2的表達.

A:在PC-3和DU145細(xì)胞中過表達NCAPD3,通過Western blot檢測EZH2蛋白水平變化情況;B:在CWR22Rv1和LNCaP中敲低NCAPD3,通過Western blot檢測EZH2蛋白水平變化情況;C:在PC-3和CWR22Rv1細(xì)胞中過表達或敲低NCAPD3,通過qRT-PCR檢測EZH2 mRNA水平變化情況;D:在PC-3和CWR22Rv1細(xì)胞中過表達或敲低NCAPD3,通過免疫熒光檢測EZH2熒光強度變化情況.圖3 NCAPD3可以調(diào)節(jié)EZH2的表達Fig.3 NCAPD3 can regulate the expression of EZH2

2.4 前列腺癌中存在AR-NCAPD3-EZH2信號通路

有研究發(fā)現(xiàn),AR和EZH2在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,本實驗室前期已經(jīng)證實NCAPD3受AR調(diào)控. 為了進一步證實AR、NCAPD3、EZH2三者之間的關(guān)系,在PC-3細(xì)胞中過表達AR,發(fā)現(xiàn)NCAPD3及EZH2的蛋白水平都有所上調(diào)(如圖4 A所示). 為了進一步驗證上述結(jié)果,在CWR22Rv1細(xì)胞中過表達AR,檢測NCAPD3及EZH2的蛋白水平變化情況,結(jié)果與圖4 A一致(如圖4 B所示). 在CWR22Rv1中敲低AR,檢測發(fā)現(xiàn)NCAPD3及EZH2的蛋白水平都有所下調(diào)(如圖4 C所示). Enzalutamide是雄激素受體信號傳導(dǎo)的抑制劑,通過競爭性阻斷雄激素與其受體的結(jié)合而發(fā)揮作用,已被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者. 使用不同濃度的Enzalutamide處理LNCaP細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)NCAPD3及EZH2都呈濃度依賴的方式下調(diào),進一步證實二者受AR調(diào)控(如圖4 D所示). 綜上,AR可以調(diào)節(jié)NCAPD3和EZH2的表達,并通過NCAPD3-EZH2信號通路促進前列腺癌的發(fā)生發(fā)展.

A:在PC-3細(xì)胞中過表達AR,檢測NCAPD3及EZH2的蛋白水平變化情況;B:在CWR22Rv1細(xì)胞中過表達AR,檢測NCAPD3及EZH2的蛋白水平變化情況;C:在CWR22Rv1細(xì)胞中敲低AR,檢測NCAPD3及EZH2的蛋白水平變化情況;D:分別使用濃度為(0、5、10、15)μmol/L的Enzalutamide處理LNCaP細(xì)胞,檢測AR、NCAPD3及EZH2蛋白水平變化情況.圖4 前列腺癌中存在AR-NCAPD3-EZH2信號通路Fig.4 AR-NCAPD3-EZH2 signaling pathway exists in prostate cancer

3 結(jié)論

前列腺癌是目前全球男性中最常見的惡性腫瘤之一,具有發(fā)病率高、起病隱匿等特點,出現(xiàn)相關(guān)病癥時往往已伴有局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移. 前列腺癌的早期診斷和治療十分重要,在早期診斷方面,PSA檢測大大提高了前列腺癌的診出率,但其低特異性也造成了過度醫(yī)療,因此,新型腫瘤標(biāo)志物的研究成為一大熱點. 此外,就病因?qū)W角度而言,引發(fā)前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制十分復(fù)雜,涉及的分子信號通路和分子網(wǎng)絡(luò)以及引起病變的因素眾多,需要更深入的大量的基礎(chǔ)研究來不斷完善.

在細(xì)胞分裂過程中,基因組的正確分離是所有生物生存的先決條件,凝縮蛋白復(fù)合物是此任務(wù)的主要控制者[13]. 有研究發(fā)現(xiàn),凝縮蛋白復(fù)合物中亞基的功能異?；虮磉_異常與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[14-16]. 凝縮蛋白有多種亞基,目前的研究均較少. 本實驗室前期通過臨床組織樣本的轉(zhuǎn)錄組測序分析了NCAP家族成員,發(fā)現(xiàn)NCAPD3在前列腺癌組織中高表達. 利用Western blot和IHC檢測,進一步驗證NCAPD3在前列腺癌細(xì)胞及臨床組織中高表達. 暗示:NCAPD3的異常高表達與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān). 此外,EZH2作為一種表觀遺傳修飾酶在多種癌癥中發(fā)揮著促癌作用. 有研究發(fā)現(xiàn),EZH2可以促進前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,有望作為前列腺癌診斷和預(yù)后的指標(biāo)以及一個新的治療靶點[13]. 由此可見,在前列腺癌中進行關(guān)于NCAPD3及EZH2的研究是很有必要的. 本研究發(fā)現(xiàn),NCAPD3和EZH2在前列腺癌細(xì)胞和組織中均高表達,且NCAPD3可以調(diào)節(jié)EZH2的表達. 但是,NCAPD3調(diào)節(jié)EZH2表達的具體分子機制尚不清楚,需要進一步探究.

AR在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用,過表達或敲低AR后發(fā)現(xiàn)NCAPD3、EZH2的表達相應(yīng)地上升或下降. Enzalutamide作為雄激素受體抑制劑,于2018年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療去勢抵抗性前列腺癌,不同濃度的Enzalutamide處理可使NCAPD3和EZH2呈濃度依賴性下調(diào),進一步證實AR可以調(diào)節(jié)NCAPD3和EZH2的表達,且提示AR可通過NCAPD3-EZH2通路促進前列腺癌的發(fā)生發(fā)展.

綜上所述,NCAPD3在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色,相關(guān)的機制研究結(jié)果為不斷完善前列腺癌的分子病因?qū)W提供實驗依據(jù),也為前列腺癌的治療提供新的潛在的分子靶點.