韓秉君，沈仕洲，2，楊鳳霞*，高文萱，丁永禎，張克強*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191；2.國家農(nóng)業(yè)環(huán)境大理觀測實驗站，云南大理 671004）

隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，抗生素濫用導(dǎo)致的抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）污染問題日益突出[1-2]。目前，糞污還田實現(xiàn)種養(yǎng)循環(huán)是各級農(nóng)業(yè)部門主推的糞污處理模式，因此ARGs不可避免地發(fā)生水平轉(zhuǎn)移而隨施肥進入農(nóng)田，進而對土壤環(huán)境造成嚴重污染[3-4]。研究表明，糞肥施用可增加農(nóng)田土壤中耐藥基因的豐度，如在施用雞糞肥的土壤中，喹諾酮類ARGs（qnrA、qnrD 和oqxB）和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs（ermA、ermB）比不施肥的對照土中同類ARGs 的豐度最高可增加4 個數(shù)量級[5]。LIU 等[6]在豬糞、雞糞和牛糞重復(fù)連續(xù)施用的農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)ARGs豐度及多樣性呈上升趨勢。土壤環(huán)境中含有大量ARGs 的耐藥菌可能會通過水平轉(zhuǎn)移由內(nèi)生菌進入植物內(nèi)部，從而將外源ARGs 轉(zhuǎn)移至植物的內(nèi)生系統(tǒng)?，F(xiàn)已在新鮮果蔬中發(fā)現(xiàn)的大量ARGs 及多種相關(guān)整合子，增加了其通過食物鏈向人類傳播的風險[7]。

不同施肥模式可顯著影響ARGs 在土壤中的積累和傳播。研究表明，施加化肥、糞肥可使ARGs 水平相較不施肥土壤增加[8-9]。尤其是糞肥施用能顯著增加土壤中ARGs 的豐度水平，引起土壤環(huán)境微生物抗性水平的提高。科學施用有機肥可能是限制ARGs在農(nóng)田傳播的有效途徑。然而，目前對不同施肥模式下農(nóng)田土壤ARGs 的分布模式及傳播研究較少，且長期施用糞肥對不同土壤深度ARGs 垂直遷移的影響尚未得到重視，即缺乏不同施肥方式下不同土層中ARGs遷移富集的研究。因此，解析不同施肥方式下，農(nóng)田土壤不同深度中ARGs 的積累分布規(guī)律及其潛在環(huán)境風險，對分析施肥方式對土壤中ARGs 的污染及傳播十分必要，同時也可進一步認識不同施肥處理模式對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的影響。本研究選取云南大理市洱海流域某水稻田作為研究對象，在減氮條件下設(shè)置施用化肥、施用有機肥、施用緩控釋肥處理，通過田間小區(qū)試驗，探究土壤中各類ARGs 在長期定量不同施肥方式下的組成及豐度變化特征，以及在受納土壤不同土層中的遷移富集規(guī)律，并統(tǒng)計ARGs 與可移動遺傳元件（MGEs）的相關(guān)關(guān)系，分析土壤中ARGs 多樣性程度與豐度水平差異的影響因素及環(huán)境風險。本研究從ARGs 防控角度為水稻肥料施用配比及用量提供科學依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

長期定位試驗田位于云南省大理市農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所大理綜合實驗站內(nèi)（25°53′34″N，100°10′27″E）。水稻試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，共8 個處理，即（1）CK：不施肥；（2）CF：常規(guī)施肥，尿素和普鈣用量為424 kg·hm-2和450 kg·hm-2；（3）T1：常規(guī)施肥減量20%，尿素和普鈣用量分別為339 kg·hm-2和375 kg·hm-2；（4）T2：糞肥等氮替代T1，糞肥用量為6 500 kg·hm-2；（5）T3：糞肥等磷替代T1，尿素補齊氮肥，糞肥和尿素用量分別為2 609 kg·hm-2和203 kg·hm-2；（6）T4：考慮糞肥礦化率25%，以氮計糞肥替代T1，糞肥用量為26 000 kg·hm-2；（7）T5：考慮糞肥礦化率25%，以磷計有機肥替代T1，尿素補齊氮肥，糞肥和尿素用量分別為10 435 kg·hm-2和203 kg·hm-2；（8）T6：緩控釋肥，緩控釋肥用量為678 kg·hm-2。每個處理3 次重復(fù)，共24 個小區(qū)，種植方式和農(nóng)田管理方式相同。2019 年10 月水稻收獲后采集土壤樣品，分別按0～20、20～50 cm 和50～80 cm 不同剖層采集。每個小區(qū)采取梅花采樣法，現(xiàn)場均勻混合，去除水稻根和可見有機物殘體后，采取四分法，留樣1 kg左右，并將土樣保存于-20 ℃冰箱，待DNA提取。

1.2 土壤樣品DNA的提取

稱取約0.5 g 土壤樣品，所有樣品采用Fast DNA SPIN Kit for soil 試劑盒（MP Bio?medicals，LLC，Santa Ana，CA，美國）并按生產(chǎn)商提供的操作手冊進行總DNA 提取，每個土壤樣品3 個重復(fù)。提取后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證DNA的質(zhì)量。提取的DNA樣品濃度使用超微量核酸蛋白檢測儀（Nanodrop 2000，德國）進行測定，所提取的DNA 樣品的A260/A280 值在1.8 左右。提取后的DNA 樣品置于-20 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)的檢測分析。

1.3 高通量熒光定量PCR與實時熒光定量檢測方法

使用WafergenSmartchip 超高通量熒光定量PCR系統(tǒng)檢測ARGs 及MGEs，共設(shè)置144 對引物，其中包括1 對16S rRNA 內(nèi)參引物。反應(yīng)體系為1×LightCy?cler 480 SYBR Gree I Master；引物濃度為500 nmol·L-1；DNA模板2 ng·μL-1，擴增反應(yīng)體系為100 nL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火處理，30 s，40 個循環(huán)；最后系統(tǒng)自動進行熔解曲線分析。使用7500 實時熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems，美國）對16S rRNA 進行實時qPCR 分析。反應(yīng)體系為20 μL，包括16S rRNA 上下游引物各0.4μL、ddH2O 6.8 μL、TB Green Premix Ex Taq（Tli RNase H Plus，Takara）10.0 μL、ROX Reference DyeⅡ0.4 μL 以及DNA 模板2 μL。qPCR 擴增過程：95 ℃預(yù)變性30 s；然后為40 個循環(huán)，包括95 ℃變性5 s 和60 ℃退火持續(xù)34 s，熔解曲線分析在60～95 ℃之間進行。其中無菌水為陰性對照，每個DNA 模板設(shè)置3 個平行，qPCR 反應(yīng)程序和標準曲線的制作參照文獻[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007計算數(shù)據(jù)的絕對豐度、相對豐度、平均值和標準差等。采用SPSS 22.0 對數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析和ANOVA 方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。采用Origin 2021軟件繪制柱狀圖、熱圖和維恩圖。

利用標準曲線計算16S rRNA 基因的絕對拷貝數(shù)，經(jīng)線性擬合分析可知其與高通量定量PCR 檢測出的16S rRNA 的相對拷貝數(shù)有較好的線性關(guān)系（r=0.956），且極顯著相關(guān)（P＜0.01），故可以使用公式（1）[11]和公式（2）計算ARGs的絕對豐度，進一步ARGs的相對豐度通過公式（3）可計算得到。

式中：ARGs是所要測定的144種抗生素抗性基因；CT是高通量熒光定量所測定的循環(huán)閾值。

2 結(jié)果與討論

2.1 長期施用糞肥稻田土壤中抗生素耐藥基因的賦存多樣性特征

選取7 大類144 種常見的ARGs 及10 種與ARGs傳播密切相關(guān)的MGEs，對其在長期施用糞肥的稻田土壤中的存在情況進行了分析檢測，結(jié)果如圖1 所示。在長期施肥土壤中，共檢出100種ARGs亞型和9種MGEs 編碼基因（7 種轉(zhuǎn)座子基因和2 種整合子基因）。從不同類別與不同作用機制來看，水稻土中檢測到的ARGs 包含了目前已知且常見的ARGs 類型，主要包括氨基糖苷類aac-ARGs（13 種）、β-內(nèi)酰胺類bla-ARGs（16 種）、磺胺類sul-ARGs（5 種）、大環(huán)內(nèi)脂類林肯酰胺類鏈陽性菌素MLSB-ARGs（20 種）、多重耐藥類MDR-ARGs（9種）、四環(huán)素類tet-ARGs（18種）和萬古霉素類van-ARGs（8種）等7大類耐藥基因，另外還有11 種其他類的ARGs。其中，四環(huán)素類ARGs和大環(huán)內(nèi)脂類林肯酰胺類鏈陽性菌素B（MLSB）的ARGs 在水稻土中檢出較多，分別達23.00% 和22.13%）；其次是與人類危害息息相關(guān)的多重耐藥類和β-內(nèi)酰胺類抗生素ARGs[12-15]，占比達16.84%和13.12%，值得引起注意。氨基糖苷類ARGs 檢出占比為10.99%；磺胺類和萬古霉素類的數(shù)量較少，占比僅為6.17%和4.90%。所有水稻土處理中檢測到ARGs的抗生素抗性機制主要是抗生素失活（Antibiotic deactivation）、抗生素外排泵（Efflux pump）和細胞核糖保護（Cellular protection），這3 類抗生素抗性機制在整體中的比例分別為37.06%、37.60%和24.84%，還有0.50%的其他或未知抗性機制（圖2）。

值得注意的是，不同施肥模式下，稻田土壤中ARGs 的賦存多樣性存在差異，其中施用糞肥土壤（T2～T5 處理）中ARGs 的多樣性最為豐富，其檢出種類可達88 種；其次為長期施用緩控釋肥的T6 處理土壤（76 種）和施用化肥（CF 和T1 處理）的稻田土壤（74種）；而在CK 土壤中也存在多種ARGs，種類亦達63種。同ARGs 污染多樣性特征相似，在施用糞肥量最大的T4 處理中檢測到的MGEs 種類最多，達7 種，顯著高于其他施肥類型的土壤。由維恩圖（圖3）可以看出，有55 種（50.5%）ARGs 亞型為6 種不同施肥模式稻田土壤中的核心ARGs（即共現(xiàn)ARGs）。其中，CK 處理中ARGs 的總檢出數(shù)量最少，基因多樣性最低；另外3 種施用肥料的處理中ARGs 的總檢出數(shù)量均有增多。施用糞肥的處理中ARGs 的總檢出數(shù)量最多，其次是施用緩控釋肥和施用化肥的處理，分別是CK 處理的1.3、1.2 倍和1.1 倍，均顯著高于CK 水稻土（P＜0.05）。施用化肥的處理中，T1 處理的ARGs 數(shù)量與CF處理相比有所降低。施用糞肥水稻土中獨有的ARGs 有7 個（blaampC-6、vatB-1、sulA/folP-3、tetL-2、tetM-2、vanRA-2、mtrC-2）。從ARGs 的檢出數(shù)量來看，在4 種不同用量的糞肥替代處理組中，T4 處理田塊中ARGs 的總檢出量最高，所有樣品中總共有210個ARGs；其次是T3 處理，檢出185 個ARGs；T2 處理和T5處理的檢出量相差較少，分別為176個和179個ARGs。施用糞肥土壤中的ARGs 相對于CK 土壤具有更復(fù)雜的多樣性，施用糞肥顯著改變了稻田土壤中的ARGs種類組成（P＜0.05）。

2.2 不同施肥模式稻田土壤中抗生素耐藥基因的污染水平及差異性

不同施肥模式下，稻田土壤中ARGs 的污染水平見圖4。結(jié)果顯示，不同處理模式下的稻田土壤ARGs 污染水平在1.0×107～1.3×1010copies·g-1的范圍內(nèi)，且不同施肥模式的稻田土壤中ARGs 的存在水平不同，整體呈現(xiàn)出施用糞肥＞施用緩控釋肥＞施用化肥＞不施肥的趨勢，這與之前的研究結(jié)果一致[16-17]。在4 種施用糞肥的處理模式中，施用糞肥較多的T3處理中ARGs 的豐度水平最高，ARGs 的總豐度達9.6×1010copies·g-1；其次為T4 和T5 處理，ARGs 總豐度分別達7.6×1010copies·g-1和7.3×1010copies·g-1；施用糞肥量較少的T2處理中ARGs的總絕對豐度最低，是T3處理的60%，其相應(yīng)的ARGs種類數(shù)也較低。從ARGs 的類別來看，不同施肥模式下稻田土壤中的優(yōu)勢基因主要包括多重耐藥類和氨基糖苷類，且各模式稻田中污染水平最高的類型均為多重耐藥類，占ARGs 總豐度的62.9%～77.4%，為1.1×107～1.3×1010copies·g-1；其次為氨基糖苷類，占ARGs 總豐度的8.2%～12.3%，為1.0×107～3.3×109copies·g-1。而四環(huán)素類和MLSB 類ARGs 在各處理稻田土壤中總豐度的占比較低，分別為4.0%～9.2%和3.0%～8.2%。此外，雖然與人類健康密切相關(guān)的β-內(nèi)酰胺類和萬古霉素類ARGs 在所有稻田處理中的豐度水平較低，但其檢出率較高，分布較為廣泛，亦應(yīng)引起重視。

為了規(guī)避不同處理中微生物量對ARGs 的影響，又進一步從ARGs 的相對豐度分析了不同模式下ARGs 的污染水平，結(jié)果見圖4。當不同施肥土壤中ARGs 的豐度水平統(tǒng)一平均到每個細胞中ARGs 的拷貝數(shù)，即將ARGs 的豐度歸一到單個細菌水平時，所有處理稻田土壤中ARGs 的相對豐度水平在1.7×10-5～3.6×10-2范圍內(nèi)。在施用糞肥的4 個處理模式中，T4 處理稻田土壤中的ARGs 總相對豐度最低，為0.13，這可能是由于T4 處理較大的糞肥施肥量顯著增加了土壤中的微生物總量，從而使得ARGs 的相對豐度低于其他糞肥施用量較少的處理；而T3 處理總相對豐度水平稍高，是T4處理的1.4倍；而T2和T5處理中的ARGs 總相對豐度水平相似，分別為0.19 和0.18。綜上可見，施用糞肥處理的相對豐度水平與絕對豐度的賦存規(guī)律不一致，這主要是因為不同施肥模式下，稻田土壤中微生物量的不同所致。從相對豐度的角度來看，稻田土的主導(dǎo)ARGs 類型與絕對豐度處理的規(guī)律一致，亦為多重耐藥類、氨基糖苷類和四環(huán)素類。豐度最高的多重耐藥類ARGs 在T5 處理中相對豐度最高（7.4×10-5～2.5×10-2），而氨基糖苷類和四環(huán)素類ARGs 則分別在施用糞肥的T2 處理和減量施用化肥的T1 處理中豐度最高，分別為6.2×10-5～2.1×10-2和8.9×10-5～8.3×10-3。MLSB 類和磺胺類ARGs 在所有處理中分別占總豐度的4.5%～11.1%和2.3%～9.6%，分別在T1 和T6 處理中相對豐度最高；與人類關(guān)系密切的β-內(nèi)酰胺類在各處理水稻田中也有檢出，但總豐度占比較低，為3.2%～6.9%；萬古霉素類的相對豐度在各處理中差異不顯著（P＞0.05），且豐度水平最低。

相比于CK處理的稻田土壤，施用化肥、糞肥以及緩控釋肥均明顯增加了稻田土壤中ARGs 的多樣性與豐度。其中，在施用糞肥處理中，ARGs的豐度水平較施用化肥處理也有較大程度的增加，多重耐藥類、氨基糖苷類以及β-內(nèi)酰胺類ARGs 水平增加較為明顯。不同施用糞肥處理中ARGs 含量的高低水平在絕對豐度與相對豐度中存在一定差異，絕對豐度較高的T4 處理，其相對豐度水平最低，這可能是由于T4處理施用糞肥量較大，土壤中微生物量（16S rRNA）顯著增加，從而使得歸一后的相對豐度水平降低。與WANG 等[8]的研究結(jié)果相似，施用化肥或糞肥的土壤與不施肥土壤相比，能夠不同程度地提高ARGs 的多樣性及豐度。

2.3 長期不同施肥模式下稻田土壤中耐藥基因的垂直積累分布規(guī)律

為了明確長期施肥稻田土壤中ARGs 的垂直積累特征，本研究又進一步調(diào)查了各施肥模式下不同土層中ARGs 的積累富集規(guī)律。調(diào)查結(jié)果顯示，在不同施肥模式各土層中含量較高的ARGs 依然是多重耐藥類、氨基糖苷類以及四環(huán)素類，但不同模式各土層中ARGs 的遷移富集規(guī)律不同。如在長期施用糞肥的4 個處理模式中，稻田土壤中ARGs 的絕對豐度總體呈現(xiàn)由表層向深層土壤遞減的趨勢，這與PAN 等在污水灌溉農(nóng)田不同土層中ARGs 的豐度變化一致[18]。且β-內(nèi)酰胺類、磺胺類、多重耐藥類和MLSB類ARGs 在耕層（0～20 cm）中的豐度分別是底層50～80 cm的2.3、1.8、1.7倍和1.5倍。此外，在施用糞肥量最大的T4處理中，各類ARGs的絕對豐度從稻田土表層到底層逐漸減少（圖5）。而在CK 稻田土中，多重耐藥類ARGs 在20～50 cm 的豐度最高，高達1.3×1010copies·g-1，分別是50～80 cm 和0～20 cm 土壤的1.7 倍和48.9倍；而四環(huán)素類、磺胺類以及MLSB 類ARGs 在0～20 cm 的豐度最高；萬古霉素類、氨基糖苷類以及β-內(nèi)酰胺類ARGs 的絕對豐度則出現(xiàn)向下累積的趨勢。施用化肥后的處理中豐度較高的多重耐藥類、氨基糖苷類和四環(huán)素類ARGs 在不同土層中的累積情況不同，氨基糖苷類在0～20 cm 的豐度最高，多重耐藥類則是在較深層的50～80 cm 豐度最高，而四環(huán)素類在各土層中無明顯豐度變化差異（P＞0.05）。T6 處理稻田土壤中，豐度最高的多重耐藥類在20～50 cm的絕對豐度最高，與CK 處理規(guī)律一致，達1.0×1010copies·g-1，不同深度土層中的各類ARGs，大部分都在施用緩控釋肥后豐度增加。

而從相對豐度來看，CK、CF、T1和T6處理的土壤中，大多數(shù)ARGs在50～80 cm 的深層土壤中的豐度相比0～20 cm 和20～50 cm 土層顯著增高（P＜0.05），其與絕對豐度中20～50 cm 和50～80 cm 的ARGs 賦存規(guī)律不一致。ARGs的相對豐度在深層土中更高的原因主要是因為深層土壤中微生物量含量較少，從而導(dǎo)致歸一后相對豐度水平較高。施用糞肥的稻田土壤中，ARGs 在50～80 cm 土層中的相對豐度水平比0～20 cm高（是0～20 cm的1.2倍）。施用糞肥量較少的T2處理中ARGs 的豐度相較其他施肥處理在深層50～80 cm土層中累積顯著（P＜0.05）。在6 個不同施肥處理模式中，心層土（30～50 cm）和底層土（60～80 cm）中ARGs的相對豐度與耕層土（0～20 cm）相比均較高，不同類型ARGs 從耕層（0～20 cm）經(jīng)20～50 cm 土層向50～80 cm 的累積速度有一定差異。不同深度的稻田土中，相對豐度呈現(xiàn)明顯垂直向下層累積的現(xiàn)象，這與之前的研究結(jié)果相同[19]?？赡苁怯捎诒狙芯坑谒臼斋@后采集稻田土壤，已超過施用肥料1個月的時間，且經(jīng)過了較長時間水稻種植的淹水時期，攜帶ARGs的細菌由水分的滲透作用加快了向下層土遷移的速度[20]。同時，糞肥的施用年限、土壤理化性質(zhì)和相關(guān)MGEs等因素的不確定性[21]，可能導(dǎo)致不同土層中不同種類ARGs的分布累積具有差異，部分在20～50 cm 富集，部分則主要在50～80 cm。綜上，施肥方式會對ARGs 在不同深度土層的分布產(chǎn)生一定的影響，但具體的遷移機制有待進一步研究。

2.4 不同施肥模式下主導(dǎo)ARGs 的譜圖特征及其與MGEs的關(guān)系

在水稻土中多重耐藥類、氨基糖苷類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類ARGs 為主導(dǎo)基因類型，占比較高；多重耐藥類不僅豐度高，且其和β-內(nèi)酰胺類ARGs 均與人類健康密切相關(guān)，因此風險性較高。在多重耐藥類ARGs 的不同亞型中，mexF 和oprJ 的豐度在各處理中檢出量均較高，其絕對豐度分別為7.3×109～2.4×1010copies·g-1和5.6×109～2.4×1010copies·g-1，是稻田土中流行的ARGs，很多關(guān)于農(nóng)田土壤的研究結(jié)果也表明多種耐藥類的豐度較高[22-24]；acrA-1、acrA-4、acrA-5、catB3 和mexE 等基因在各處理中均有檢出且豐度也較高，平均豐度達108copies·g-1；cfr及yidY/mdtL-1 的豐度較低，在施肥處理后才有檢出。氨基糖苷類ARGs 中，aac（6′）-Ib（akaaacA4）-3 的豐度最高，其次為aacC，絕對豐度水平分別為2.5×109～5.5×109cop?ies·g-1和8.7×107～2.4×109copies·g-1；aacC、aacC1、aa?dA-1、aadA-2、aadD、aadE 和strB 也在水稻土中普遍存在。四環(huán)素類ARGs中，豐度最高的是tetA-2，所有處理的平均豐度均達到109copies·g-1；其次是tetG-1和tetB-2，分別為tetA-2 的19%和14%。β-內(nèi)酰胺類ARGs 在稻田土中豐度最高的是fox5，為2.8×108～2.6×109copies·g-1，blaVEB和blaOXA1-2豐度略低于fox5，平均豐度在107copies·g-1水平；blaOXA-1/blaOXA-3、blaOXA1-1、blaOXA1-2、blaTEM和penA 也在各處理中普遍存在。多重耐藥類、氨基糖苷類、四環(huán)素類以及β-內(nèi)酰胺類ARGs的總絕對豐度，施用化肥、糞肥以及緩控釋肥的3 種處理相對于未施肥土壤中均有增多，分別增加了0.4、1.6 倍和1.1 倍，其中施用糞肥和緩控釋肥的水稻土顯著富集了ARGs。

研究表明，ARGs 在環(huán)境微生物間的傳播和轉(zhuǎn)移與MEGs 緊密相關(guān)[25-26]，因此對ARGs 的絕對豐度與MGEs 之間的相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示（表1），部分ARGs與轉(zhuǎn)座子基因、整合子基因存在顯著相關(guān)性，表明MGEs 可能促進了ARGs 在稻田土壤中的遷移和傳播。有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境微生物中的intI1（clinic）與許多ARGs 有關(guān)[27]，aadA、tetG、acrA-1、mexE 等均與intI1（clinic）顯著相關(guān)。本研究中intI-1（clinic）與多重耐藥類ARGs（acrA-1、acrA-4、acrA-5、mexF 和oprJ）以及β-內(nèi)酰胺類（blaampC-4、blaCMY2-2、blaCTX-M-2、blaCTX-M-4和fox5）有顯著正相關(guān)，進一步證明稻田土壤中intI1 整合子基因?qū)RGs 的傳播轉(zhuǎn)移起著重要作用。此外，轉(zhuǎn)座子基因也與高豐度的基因顯著相關(guān)，如tnpA-3與多重耐藥類ARGs 中的oprJ 以及tnpA-3、tnpA-4 與β-內(nèi)酰胺類ARGs中的fox5。在施用糞肥及施用緩控釋肥的處理中，檢測到MGEs 的豐度分別是CK 處理稻田土的2.0 倍和2.1 倍，表明MGEs 在施用糞肥及緩控釋肥的水稻土中富集。在intI-1（clinic）、tnpA-3和tnpA-4 等主要MGEs 的豐度較高的情況下，可能導(dǎo)致ARGs 的基因水平轉(zhuǎn)移速度加快，進而促進了其在稻田土中的進一步傳播、富集和演化。ARGs通過MGEs水平轉(zhuǎn)移作為基因的重要轉(zhuǎn)移方式應(yīng)在施肥土壤環(huán)境中得到重視，并應(yīng)加強農(nóng)田土壤中ARGs 的水平轉(zhuǎn)移機制的研究。

表1 耐藥基因與可移動遺傳元件的相關(guān)性Table 1 Correlation analysis between ARGs and MGEs

3 結(jié)論

（1）不同施肥模式下，稻田土壤中ARGs 具有不同的分布特征，其中ARGs 絕對豐度呈現(xiàn)施用糞肥土壤＞施用緩控釋肥土壤＞施用化肥土壤＞不施肥對照土壤，但不同施肥處理模式下的稻田土中優(yōu)勢基因基本一致，多為多重耐藥類、氨基糖苷類和四環(huán)素類ARGs。

（2）不同施肥模式下，稻田土壤中ARGs 和MGEs的賦存多樣性存在顯著差異，其中施加糞肥稻田土壤中的ARGs 的賦存多樣性和MGEs 的種類顯著高于不施肥、施加化肥和施加緩控釋肥的田塊，不施肥模式則顯著低于其他處理模式。

（3）不同深度土層中稻田土壤ARGs 的相對豐度呈現(xiàn)向下富集的趨勢，轉(zhuǎn)移傳播的速度可能受水稻生長條件、可移動遺傳元件、施肥方式等自然環(huán)境和人為因素影響，其在不同土層中的傳播機制仍需進一步探究。

（4）長期施肥模式下，不同土層土壤中的ARGs水平與MGEs 豐度顯著相關(guān)，其中intI-1（clinic）與豐度較高的多重耐藥類和β-內(nèi)酰胺類中的多種ARGs有極顯著正相關(guān)性（P＜0.01），表明土壤中MGEs 可能促進了ARGs 的傳播擴增，加劇了農(nóng)田土壤的ARGs污染。