徐建霞，丁延慶，曹 寧，程 斌，高 旭，鄒桂花，張立異

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所，貴陽 550006；2.浙江省作物分子育種工程技術(shù)研究中心，杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所，杭州 310021)

高粱[Sorghumbicolor(L.)Moench]是世界第五大糧食作物[1]，起源于干旱、炎熱和貧瘠的非洲地區(qū)，與其他糧食作物(小麥、玉米和水稻)相比，具有較強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特性[2-3]。我國高粱主栽區(qū)為西南、西北和東北，主要分為春作和夏作。西南地區(qū)處于春作區(qū)，播種時(shí)間較早。由于西南地區(qū)倒春寒現(xiàn)象頻發(fā)，作為喜溫作物的高粱對低溫極為敏感，早春寡照低溫多雨天氣的出現(xiàn)，引起高粱種子在土壤中粉種或霉?fàn)€，導(dǎo)致萌發(fā)率、出苗率降低，還會導(dǎo)致出苗后植株長勢弱且生長緩慢，造成低溫?fù)p傷進(jìn)而影響產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。因此，了解高粱的耐冷綜合評價(jià)體系，篩選和鑒定出耐冷高粱種質(zhì)，對于選育穩(wěn)定高產(chǎn)的耐冷型高粱品種(品系)十分必要。

高粱不同品種(品系)間耐冷性比較及低溫脅迫生理機(jī)制方面的研究國內(nèi)外已有報(bào)道，Major等[5]對高粱品種Pride P 130苗期進(jìn)行短期低溫處理后發(fā)現(xiàn)，低溫不僅延遲了開花天數(shù)還使分蘗數(shù)增多，但對株高和籽粒產(chǎn)量等性狀的影響不顯著。Upadhyaya等[6]研究發(fā)現(xiàn)，12 ℃顯著影響高粱種子的萌發(fā)能力，可作為高粱萌發(fā)期耐低溫的篩選溫度，F(xiàn)ranks等[7]研究認(rèn)為，15 ℃適合作為高粱萌發(fā)期的鑒定溫度。龔文娟等[8]對407份高粱的低溫萌發(fā)篩選試驗(yàn)，初步確定高粱萌發(fā)的最低溫度為8 ℃。張麗霞等[9]也認(rèn)為，在8 ℃低溫脅迫下相對萌發(fā)勢和相對萌發(fā)率的高低可作為評價(jià)高粱種子的耐冷能力。目前，前人在評價(jià)高粱萌發(fā)期和幼苗期耐低溫條件上存在許多差異，且前人研究的指標(biāo)都比較單一，而高粱籽粒品質(zhì)以及品種間的耐冷性比較研究鮮見報(bào)道。為了進(jìn)一步開展高粱耐冷性研究，推進(jìn)西南地區(qū)酒用高粱育種工作，本研究采用257份粒用高粱為試驗(yàn)材料，在10 ℃條件下測定種子萌發(fā)率以及幼苗4 ℃處理7 d后耐冷等級，結(jié)合籽粒品質(zhì)，采用隸屬函數(shù)和聚類分析法科學(xué)評價(jià)高粱幼苗的耐冷性。建立多因素高粱耐冷種質(zhì)鑒定綜合評價(jià)指標(biāo)，為耐冷高粱品種(品系)的選育及高粱耐冷性科學(xué)鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為257份粒用高粱(編號為：GZ 001～GZ 257)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所和貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所提供，分別來源于我國16個(gè)省市以及美國、日本和蘇丹等國(表1)。

表1 高粱種質(zhì)資源的來源及數(shù)目Table 1 Sources and numbers of sorghum germplasm resources

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1粒用高粱種質(zhì)資源萌發(fā)期耐冷性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于試驗(yàn)材料較多，基于前人研究結(jié)果，結(jié)合貴州近幾年來4月份春播的最低溫度，在試驗(yàn)之前以紅纓子、河農(nóng)16、BTx 623等10份材料進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，選取8 ℃和10 ℃作為高粱種質(zhì)資源萌發(fā)期耐冷性試驗(yàn)溫度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些高粱品種在8 ℃下培養(yǎng)10 d發(fā)芽率都較低，因此選取10 ℃為發(fā)芽溫度。

采用RXZ-1000 B型人工氣候箱進(jìn)行種子控溫萌發(fā)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光周期16 h/8 h，光照強(qiáng)度12 000 lx，濕度60%。挑選籽粒飽滿的種子，用次氯酸鈉溶液(5%)消毒15 min，再用純水沖凈拭干，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放30粒種子，作好標(biāo)記，加入15 mL蒸餾水后置人工氣候箱進(jìn)行培養(yǎng)。每天補(bǔ)充一次蒸餾水，培養(yǎng)10 d后記錄每個(gè)材料的萌發(fā)率。每處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。

1.2.2粒用高粱種質(zhì)資源幼苗期耐冷性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照《高粱種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》以及張瑞棟等[10]的研究方法，將參試材料種于花盆內(nèi)，每個(gè)材料30粒種子。置于人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光周期為16 h/8 h，溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為12 000 lx，待高粱種子萌發(fā)生長至三葉一心后，選取大小一致的幼苗各10株，置于脅迫溫度為4 ℃的人工氣候箱中進(jìn)行低溫處理(其余培養(yǎng)條件不變)，定期澆水。每處理重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。7 d后記錄幼苗表觀特征，進(jìn)行耐冷等級劃分。

1.3 測定指標(biāo)及方法

種子萌發(fā)率及統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)[9-10]：10 ℃處理后第10天統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)皿中種子的萌發(fā)粒數(shù)(以種子胚根達(dá)種子長，胚芽達(dá)種子長的二分之一為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn))，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 高粱種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)如表2。

表2 高粱種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Statistical standard of sorghum seed germination rate

萌發(fā)率(%)=(第10天的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

低溫脅迫下幼苗存活率及耐冷等級劃分[11]：4 ℃處理后第7天時(shí)統(tǒng)計(jì)花盆中幼苗的存活數(shù)，記錄幼苗表觀形態(tài)特征，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和耐冷等級劃分(表3)。耐冷等級描述如表3。

幼苗存活率(%)=(第7天的幼苗種子存活數(shù)/供試幼苗數(shù))×100%。

高粱籽粒品質(zhì)(表3)參照王勇生等[12]的方法測定。

表3 幼苗耐冷等級和表觀形態(tài)特征Table 3 Cold tolerance grade and morphological characteristics of seedlings

耐冷性綜合評價(jià)方法：隸屬函數(shù)平均值法作為植物抗逆生理實(shí)驗(yàn)中常用的方法，通過多項(xiàng)指標(biāo)的綜合評價(jià)來合理準(zhǔn)確反映植物的抗逆性，從而消除個(gè)別指標(biāo)帶來的片面性和不可靠性，能客觀比較出供試材料抗逆性的大小及差異。隸屬函數(shù)平均值(U)越大，說明植物的抗逆性(本文中主要為耐冷性)越強(qiáng)[13]。

與耐冷性呈正相關(guān)的隸屬函數(shù)公式為：

Uij=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

與耐冷性呈負(fù)相關(guān)的隸屬函數(shù)公式為：

Uij=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

隸屬函數(shù)平均值U計(jì)算公式為：

式中，Uij為i品種j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij為i品種j指標(biāo)的耐冷系數(shù)；Xmax為所有品種中此指標(biāo)的最大值；Xmin為所有品種中此指標(biāo)的最小值。Ui是為i品種的各性狀的平均耐寒隸屬函數(shù)值。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2007軟件和Origin 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及制圖，利用 SPSS 20統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和耐冷性指標(biāo)的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對高粱種子萌發(fā)率的影響

低溫條件下種子的萌發(fā)率是評價(jià)種子耐冷的重要指標(biāo)之一。257份高粱種質(zhì)資源在低溫(10 ℃)脅迫下的試驗(yàn)結(jié)果顯示，種子低溫萌發(fā)率較好的材料有120份(46.70%)，包括達(dá)到一級的60份材料和二級的60份材料，而低溫萌發(fā)率較差的材料有57份(22.18%)，包括達(dá)到了五級的27份材料和六級的30份材料(表4)。

表4 低溫條件下高粱種子萌發(fā)等級樣品數(shù)占比Table 4 Number and percentage of sorghum seed germination grade samples under low temperature

2.2 低溫脅迫對高粱幼苗表型特征的影響

不同材料的高粱幼苗經(jīng)過4 ℃低溫脅迫處理7 d(其余培養(yǎng)條件不變)后，均伴有葉片失水和顏色變淺等現(xiàn)象，部分材料還出現(xiàn)葉片萎蔫、下垂，局部壞死等現(xiàn)象；結(jié)合幼苗表觀形態(tài)特征(表3)，將耐冷等級劃分為五級。幼苗耐冷等級達(dá)到一級、二級和三級的材料具有較好的耐冷性，占所有樣品比率的68.87%(177份/257份)，而耐冷等級為四級和五級的材料耐冷性較差，占總樣品比例的31.13%(80份/257份)(表5)。說明經(jīng)過4 ℃脅迫7 d后，不同高粱幼苗均會受到不同程度的損傷，對低溫的抵抗能力表現(xiàn)不同。

表5 高粱幼苗耐冷等級樣品數(shù)占比Table 5 Number and percentage of cold tolerance grade samples of sorghum seedlings

2.3 粒色與耐低溫的關(guān)系

本研究所用的257份種質(zhì)中，粒色(白色、灰白色)較淺的材料為20份、占比7.78%；粒色(褐色和紅色)較深的材料為210份、占比81.71%。種子萌發(fā)率達(dá)到一級的材料共有60份，其中白粒材料最少(4份)，紅粒材料最多(33份)，分別占6.67%和55%(表6)。

在10 ℃低溫處理后，種子萌發(fā)率達(dá)到一級的材料白粒最少(為4份)，但占白粒材料的百分比卻最多(66.7%)；而紅粒和褐粒材料雖然最多，但篩選到的較耐低溫材料比例卻相對較低，占比分別為14.12%和26.4%(表6)。

表6 高粱粒色Table 6 Color of sorghum grain

2.4 種子萌發(fā)率、幼苗存活率與籽粒品質(zhì)相關(guān)性分析

將種子萌發(fā)率、幼苗存活率與高粱籽粒成分(直鏈淀粉、支鏈淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)、含水量和單寧)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果(表7)表明，種子萌發(fā)率與種子脂肪含量和蛋白質(zhì)含量之間呈極顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)R值分別為0.253和0.164(p<0.01)，而幼苗存活率只與脂肪含量顯著相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)R值為0.128(p<0.05)。此外，籽粒品質(zhì)性狀之間也表現(xiàn)出相關(guān)性；直鏈淀粉含量與支鏈淀粉呈極顯著負(fù)相關(guān)(p<0.01)，脂肪與蛋白質(zhì)呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)，單寧含量與顏色深淺呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)。

表7 高粱種子萌發(fā)率與籽粒品質(zhì)之間的相關(guān)系數(shù)Table 7 Correlation coefficient between sorghum seed germination rate and grain quality

2.5 低溫脅迫下種子高萌發(fā)率和苗期高耐冷能力種質(zhì)篩選

在低溫脅迫條件下，種子萌發(fā)率和苗期耐冷能力之間關(guān)系復(fù)雜，同樣存在萌發(fā)率高、苗期耐冷能力強(qiáng)的材料。根據(jù)表2和表3的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，將257份種質(zhì)在低溫條件下的種子萌發(fā)率和苗期耐冷能力分別劃分到不同的等級中(表4、表5)，其中種子萌發(fā)率達(dá)到一級的樣品數(shù)為60份，幼苗耐冷等級達(dá)到一級的樣品數(shù)為36份，利用維恩圖分析得出，種子萌發(fā)率和苗期耐冷能力均達(dá)到一級(高耐冷)的種質(zhì)有7份(圖1)，其中北方材料5份：GZ 001(253)、GZ 066(蛇眼)、GZ 125(1030)、GZ 162(257)和GZ 235(河農(nóng)16號)，南方材料2份：GZ 241(瀘州紅2號)和GZ 249(黔高1號)。

圖1 低溫處理下種子萌發(fā)率和苗期耐冷能力維恩圖Fig.1 Venn diagram of seed germination rate and seedling cold tolerance under low temperature treatment

2.6 低溫脅迫下7份高耐冷高粱種質(zhì)隸屬函數(shù)綜合評價(jià)

對低溫脅迫下7份高耐冷高粱種質(zhì)耐冷指標(biāo)平均隸屬函數(shù)值進(jìn)行綜合評價(jià)，U值越大，表示高粱幼苗的耐冷性越強(qiáng)。低溫脅迫下7份高粱種質(zhì)耐冷性U值從大到小的排序?yàn)椋篏Z 066、GZ 249、GZ 241、GZ 001、GZ 162、GZ 125、GZ 235(表8)。同時(shí)通過基于歐式平均距離法對U值進(jìn)行聚類分析 ，將7份高耐冷高粱又分為三類，GZ 066、GZ 249和GZ 241 屬于高強(qiáng)耐冷類型，GZ 001和GZ 162屬于較強(qiáng)耐冷類型，GZ 125和GZ 235屬于強(qiáng)耐冷類型(圖2)。

表8 7份高粱種質(zhì)耐冷指標(biāo)隸屬函數(shù)值及U值Table 8 Membership function and U value of cold tolerance index of 7 sorghum germplasms

圖2 7份耐冷高粱種質(zhì)聚類樹狀圖Fig.2 Cluster tree diagram of 7 cold-tolerant sorghum germplasms

3 討 論

高粱產(chǎn)量往往受到播種地點(diǎn)、播種時(shí)間等因素的影響，特別是早春播種的高粱更易遭受低溫脅迫而導(dǎo)致種子萌發(fā)出苗生長受損，嚴(yán)重影響當(dāng)季生產(chǎn)[9,14]。因此，篩選耐低溫種質(zhì)資源，以及明確相關(guān)作用機(jī)理，對今后高粱品種的選育和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要作用。

本研究通過對257份粒用高粱10 ℃低溫脅迫處理結(jié)果得出，種子萌發(fā)率達(dá)到一級的樣品數(shù)為60份，占總樣品的23.35%；高粱幼苗4 ℃低溫脅迫處理7 d后，幼苗耐冷等級達(dá)到一級的樣品數(shù)為36份，占總樣品的14.01%；而種子萌發(fā)率和幼苗耐冷能力均達(dá)到一級的材料只有7份。本研究結(jié)果與已報(bào)道的高粱耐冷試驗(yàn)結(jié)果相似。陳香蘭等[15]從1 398份高粱材料中(其中471份材料用于萌發(fā)期抗冷材料的篩選，927份材料用于苗期抗冷材料的篩選)只選出9份材料耐低溫性，而張桂香等[16]對238份高粱材料進(jìn)行芽期和苗期的耐低溫篩選，獲得兩個(gè)時(shí)期都耐低溫的材料只有3份。上述研究結(jié)果也表明，種子萌發(fā)期與苗期抗低溫能力并無明顯相關(guān)性。

高粱粒色與耐冷性之間的關(guān)系已有相關(guān)報(bào)道。張麗霞等[9]對631份高粱材料進(jìn)行了芽期耐冷性篩選，從中鑒定出芽期耐冷一級種質(zhì)91份，其中白粒最多為47份(30.72%)；黃粒最少為7份(11.48%)。但張桂香等[16]對238份高粱材料進(jìn)行了芽期耐冷性鑒定與評價(jià)，從中篩選出了芽期耐冷種質(zhì)最多為紅粒材料(7份)。本研究中低溫處理后相對萌發(fā)率達(dá)到一級的白色籽粒占比最大(55%)，耐低溫的深色籽粒比例較低(6.67%)?？赡苁窃囼?yàn)材料中白色籽粒高粱種質(zhì)很少導(dǎo)致。

本研究發(fā)現(xiàn)，種子萌發(fā)率與脂肪和蛋白含量之間表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)性。脂肪作為種子高能量貯藏物質(zhì)，是植物生長發(fā)育中不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)。方升佐等[17]和陳建華等[18]分別對青檀種子和棉花種子中脂肪含量與種子萌發(fā)率的研究表明，脂肪含量與種子萌發(fā)呈正相關(guān)，即脂肪含量越高種子萌發(fā)率越高。本研究也顯示，種子脂肪含量越高，低溫脅迫下萌發(fā)率越高，其原因是種子油脂在脂肪酶的作用下水解為甘油及游離脂肪酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為葡萄糖為種子萌發(fā)和幼苗生長提供必要的物質(zhì)與能量[19]。 蛋白質(zhì)除了提供能量外，還具有結(jié)構(gòu)性和滲透調(diào)節(jié)等功能，因此蛋白質(zhì)含量與種子萌發(fā)之間的關(guān)系在不同的作物中結(jié)果不一樣。對油脂類作物花生[20]和大豆[21]的研究發(fā)現(xiàn)，其貯藏蛋白含量高低與種子萌發(fā)不相關(guān)。但對于淀粉類種子，如小麥[22]、 甜玉米[23]以及高粱[24]等的研究結(jié)果均表明，蛋白質(zhì)含量與種子萌發(fā)速率和幼苗生長情況呈正相關(guān)，與本研究得出的結(jié)果相似。

植物的耐冷性作為數(shù)量性狀受多種因素的影響，不同種質(zhì)的某一指標(biāo)在相同低溫脅迫條件下表現(xiàn)不同，難以采用單一指標(biāo)對植物耐冷性強(qiáng)弱做出判斷和比較[25-26]。因此，采用多項(xiàng)耐冷指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)值的綜合評價(jià)，才能比較準(zhǔn)確地反映某一種質(zhì)的耐冷水平[13]。由于粒用高粱的耐冷性因種質(zhì)不同而出現(xiàn)差異，本試驗(yàn)確定種子萌發(fā)率、幼苗存活率、脂肪和蛋白質(zhì)含量等4個(gè)指標(biāo)可以用于高粱耐冷性鑒定。因此，采用的綜合評價(jià)方法可用于評價(jià)粒用高粱耐冷性的鑒定。

4 結(jié) 論

257份籽粒高粱在10 ℃低溫脅迫下種子萌發(fā)率達(dá)到一級和4 ℃低溫脅迫處理7 d后幼苗耐冷等級也達(dá)到一級的樣品數(shù)為7份。相關(guān)性分析顯示種子萌發(fā)率、幼苗存活率、脂肪含量和蛋白質(zhì)含量等4個(gè)指標(biāo)與耐冷性具有顯著相關(guān)性，可作為高粱耐冷性鑒定指標(biāo)。通過隸屬函數(shù)和聚類分析最終確定7份耐冷高粱種質(zhì)的耐冷性依次為：GZ 066、GZ 249、GZ 241、GZ 001、GZ 162、GZ 125、GZ 235，并將其分為三類(高強(qiáng)、中強(qiáng)、強(qiáng))。本研究結(jié)果建立了一套高粱耐冷種質(zhì)鑒定綜合評價(jià)指標(biāo)，且篩選出耐冷性較強(qiáng)的種質(zhì)，為下一步深入研究高粱耐冷性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。