唐鳳鸞，陳月圓，李典鵬，趙 健

(廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所/廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點實驗室，廣西 桂林 541006)

桉樹原產(chǎn)于澳大利亞，是一種速生工業(yè)用材樹種。由于其生長速度快、適應(yīng)性廣、經(jīng)濟效益好，被引種到世界各地。然而，過量種植桉樹已造成了一系列生態(tài)問題，如生物多樣性下降[1-2]、土壤退化[3]、對本地物種的化感作用[4]等?；形镔|(zhì)是植物產(chǎn)生和積累的次生代謝物，幾乎存在于所有植物物種組織中[5-9]。植物通過釋放化感物質(zhì)調(diào)節(jié)其附近的土壤微生物群落、影響草食動物、改變周圍環(huán)境的化學(xué)和物理性質(zhì)，或直接抑制種子萌發(fā)、生長和競爭性植物物種的發(fā)育[10-11]。

桉樹能釋放大量揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)一部分被土壤顆粒吸附或溶解在水中[12]，其中部分化合物通過根系吸收對其他物種造成傷害，從而影響植物生長[13-14]。如檸檬桉揮發(fā)物對雜草和農(nóng)作物的生長具有化感作用，剛果12號桉揮發(fā)物對中國本土豆科草本植物具有抑制作用[15]，尾葉桉揮發(fā)物對金合歡和合歡幼苗生長有明顯抑制作用[16]。盡管現(xiàn)有文獻對桉樹葉片總揮發(fā)物的化感作用進行了較廣泛的研究，但很少涉及揮發(fā)物中單體化合物的化感作用。事實上，揮發(fā)物的某些成分可明顯抑制或刺激其他物種的種子萌發(fā)和胚根伸長[17-18]。本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對廣西主要人工林巨尾桉的葉片精油進行分析，并進一步探討精油及主要化合物對黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長的影響，旨在評估人工桉樹林對周邊地區(qū)黃瓜生產(chǎn)的影響。

1 材料與方法

1.1 材 料

在廣西國有黃冕林場，選取四年生巨尾桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla)人工林為采樣基地，將其分為東、南、西、北、中等5個部分。于2019年5月，在每個部分隨機選取10棵長勢均勻、無病蟲危害的巨尾桉樹，將每棵樹的樹冠分為上、中、下三層，分別從每一層的東、南、西、北4個方向收集5個當(dāng)年生粗壯枝條，帶回實驗室后，摘取每條枝條的第6～15片成熟功能葉(從頂端開始數(shù))，擦洗干凈，備用。

黃瓜(CucumissativusLinn)種子為山東省新泰市強大種業(yè)有限公司生產(chǎn)的油亮3-8 F1品種。發(fā)芽試驗前，種子先用0.1%高錳酸鉀溶液浸泡30 min進行表面消毒。

1.2 精油提取及分析

將采集的巨尾桉新鮮葉片切成約2 cm大小的碎片，取適量葉片置于圓底燒瓶內(nèi)加入蒸餾水，用揮發(fā)油提取器按常規(guī)水蒸氣蒸餾法加熱微沸4 h，得到油狀物經(jīng)分液漏斗用正己烷萃取分離，無水硫酸鈉干燥24 h，分離得到淡黃色精油，在4 ℃下保存。然后在所得精油中加入適量正己烷溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。

使用7890 A/5975 C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司生產(chǎn))對精油進行分析。色譜條件為：HP-5 MS 5% Phenyl-Methyl Siloxane(30 m × 250 μm × 0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱；柱溫設(shè)定為以3 ℃·min-1的速度由60 ℃升至120 ℃，然后再以5 ℃·min-1的速度升至250 ℃；氣化室溫度為250 ℃；FID檢測器加熱器250 ℃,載氣為體積分?jǐn)?shù)99.999%的高純氦氣，載氣流量為1.0 mL·min-1；進樣方式為GC自動進樣器，進樣量為1.0 μL，分流比為30∶1。質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子能量為70 eV，MS四級桿溫度為150 ℃，接口溫度280 ℃。

檢測結(jié)果與Agilent NIST 05 a數(shù)據(jù)庫中化合物的質(zhì)譜進行比較，確定巨尾桉精油中的化合物，并在色譜條件下用C 6-C 28標(biāo)準(zhǔn)混合物計算樣品的保留指數(shù)(RI)。分析3次，計算各成分的相對百分比為平均值。

1.3 生物檢測方法

以黃瓜為測試植物，通過檢測種子萌發(fā)及胚根生長，研究巨尾桉精油及含量達1%的主要化合物的化感作用。

在培養(yǎng)皿(直徑90 mm)底部墊5層濾紙(用于吸水以保持濕度)，將滅菌后的黃瓜種子均勻置于培養(yǎng)皿上，每個培養(yǎng)皿中加入7 mL待測溶液(精油或已知濃度的化合物)，以蒸餾水作為對照。其中水溶性低的化合物溶解于水∶丙酮比為97∶3的混合物中(單獨使用這種混合物與單獨用水的對照組相比沒有表現(xiàn)出明顯差異)。培養(yǎng)皿放置于溫度為(25±1)℃，相對濕度為70%，連續(xù)光照20 μmol·(m2·s)-1或黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理重復(fù)5次，每個培養(yǎng)皿播20粒種子。在培養(yǎng)皿中直接觀察種子萌發(fā)情況，每12 h觀察一次，以胚根突破種皮為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計萌發(fā)率，5 d后測定胚根長度。

用于測試的純化合物購自日本東京TCI公司。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS 16.0軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨尾桉精油分析結(jié)果

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對巨尾桉精油成份進行分析，結(jié)果鑒定出52種化合物，具體見表1。其中相對含量較高的化合物有1,8-桉葉素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)，占總含量的81.36%，為巨尾桉精油的主要成分。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點將精油成分分為五類，第一類為含氧單萜類化合物(57.40%)，含量最高的為1,8-桉葉素(41.82%)，其次為α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)，α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)；第二類為單萜烯類化合物(41.41%)，主要成分為α-蒎烯 (39.54%)；其他化合物僅占1.19%。

表1 巨尾桉精油化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of essential oil of E. urophydis

2.2 巨尾桉精油對黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長的影響

在光照和黑暗條件下，濃度為10～300 μg·mL-1的巨尾桉精油處理黃瓜種子120 h后的結(jié)果見表2。精油對黃瓜種子萌發(fā)的抑制作用存在明顯的劑量依賴，隨使用濃度的增加而加強，且黑暗條件處理較光照條件更為明顯；濃度為10～20 μg·mL-1時，光照條件下種子萌發(fā)率與對照無明顯差異，但黑暗條件下萌發(fā)抑制率達12%～16%；濃度為150 μg·mL-1時嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)，抑制率達84%～88%。精油對黃瓜胚根生長的影響較大，在所有測試條件和濃度下均能完全抑制胚根生長。

表2 巨尾桉精油對黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長的影響Table 2 Effects of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.3 巨尾桉精油中主要化合物對黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長的影響

在精油實驗基礎(chǔ)上，采用同樣的生物檢測法，對含量在1%以上的5個主要化合物進行化感作用測試。由表3可知，各測試化合物在光照和黑暗條件下對黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長的影響效果無顯著差異，這與精油實驗中黑暗較光照條件抑制作用強的結(jié)果存在一定差異。測試化合物中，α-松油醇可完全抑制黃瓜種子萌發(fā)(抑制率100%)；α-松油醇乙酸萜烯和1,8-桉葉素的效果較接近，萌發(fā)抑制率在52%～68%之間，且能完全抑制胚根生長；α-蒎烯和2-茨醇對萌發(fā)的抑制效果不明顯(6%～13%)，但α-蒎烯處理的種子胚根完全不能生長，而2-茨醇對胚根長生的抑制率分別為21%和40%。由此可見，巨尾桉精油主要化合物均能嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)或胚根生長。

表3 主要化合物對黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長的影響Table 3 Effects of main compounds of E. urophydis essential oil on seed germination and radicle growth of cucumber

2.4 不同濃度化合物對黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長的影響

選取抑制效果較強的3種化合物進行低濃度實驗，結(jié)果見表4。發(fā)現(xiàn)濃度為50 μg·mL-1時，3種化合物均能極顯著抑制黃瓜種子萌發(fā)，且完全抑制胚根生長。隨著使用濃度的下降各化合物的抑制效果出現(xiàn)明顯差異，當(dāng)濃度為2 μg·mL-1和10 μg·mL-1時，α-松油醇乙酸萜烯對黃瓜種子萌發(fā)的影響很小，但能完全抑制胚根生長；10 μg·mL-1的1,8-桉葉素對光照條件下的種子萌發(fā)，及光照和黑暗條件下胚根生長的抑制效果顯著，而2 μg·mL-1的影響不明顯；10 μg·mL-1的α-松油醇能100%抑制黃瓜種子萌發(fā)，且濃度低至2 μg·mL-1時抑制率仍保持22%和32%，可見α-松油醇對黃瓜生產(chǎn)影響最大。

表4 低濃度α-松油醇乙酸萜烯、1,8-桉葉素和α-松油醇對黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長的影響Table 4 Effects of low concentration α-terpinol terpene acetate, 1,8-cineole and α-terpinol on seed germination and radicle growth of cucumber

3 結(jié)論與討論

巨尾桉精油共檢出52種化合物，根據(jù)結(jié)構(gòu)特點分為五大類，其主要成分1,8-桉葉素(41.82%)、α-蒎烯 (39.54%)、α-松油醇乙酸萜烯(6.17%)、α-松油醇(4.33%)和2-茨醇(1.57%)均屬于含氧單萜類和單萜烯類化合物。前人已對多個桉樹品種的葉片精油成分進行了分析，李奧欣等[19]報道，尾葉桉精油檢出92種化合物，含量大于1%的有7種，其中最高的3種為1,8-桉油素(64.1%)、α-蒎烯(11.4%)、α-乙酸松油酯(7.9%)；柳桉葉揮發(fā)油檢出42種化合物，含量大于1%的有8種，含量最高的3種為對傘花烴(24.45%)、α-蒎烯(16.53%)、1，8-桉葉油素(9.16%)[20]；窿緣桉葉精油檢出24種化合物，含量大于1%的有11種，含量排前3的為1，8-桉葉素(38.82%)，α-蒎烯(13.52%)、對傘花烴(12.04%)[21]。通過對比發(fā)現(xiàn)，不同品種桉樹葉精油的化合物數(shù)量、主成分種類及含量存在較大差異，但1,8-桉葉素、α-蒎烯作為含量最高的化合物出現(xiàn)在不同的品種中，成為桉樹葉精油的共同特征。

巨尾桉精油在黑暗條件下對黃瓜種子萌發(fā)的抑制作用較光照強，而其主要化合物在光照和黑暗條件下的作用效果差異不明顯。原因可能是精油中不同化合物對測試物種的抑制作用差異較大，且抑制作用與其在精油中的含量大小無直接關(guān)系。本研究中含量為4.33%的α-松油醇處理濃度為2 μg·mL-1時，在光照和黑暗條件下仍對黃瓜種子萌發(fā)保持22%和32%抑制率，而含量達39.54%的α-蒎烯處理濃度為100 μg·mL-1時，在光照和黑暗條件下的抑制率分別只有7%和13%，含量很低的化合物的抑制作用通過聚集最終成為影響其他物種生長發(fā)育的主要因素。此外，巨尾桉精油在光照和黑暗條件下的作用效果，還與蕓香精油對蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用在光照條件下明顯比黑暗條件下強[17]的結(jié)果存在較大差異，這可能是不同樹種精油成分及受試物種特性差異所致。

α-蒎烯(39.54%)和1,8-桉葉素(41.82%)為巨尾桉精油中最主要的兩個化合物，但其對黃瓜種子萌發(fā)和生長的影響差異較大，無論是在光照還是在黑暗條件下α-蒎烯的抑制作用均不明顯，而1,8-桉葉素呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，抑制作用隨使用濃度的下降而快速減弱。這與Saban等[22]報道的單萜烯對藜麥種子萌發(fā)無植物毒性作用，及含氧單萜化合物比單萜烯對種子萌發(fā)具有更強的抑制作用的結(jié)果一致。含氧單萜類化合物α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯均對黃瓜種子萌發(fā)和生長表現(xiàn)出了顯著的抑制作用，尤其是α-松油醇，雖然其在精油中含量僅為4.33%，但它在所有被測試化合物中抑制作用最強，即使?jié)舛冉档? μg·mL-1仍能嚴(yán)重抑制黃瓜種子萌發(fā)和生長。2-茨醇雖然也是一種含氧單萜化合物，但其抑制作用在所有測試化合物中最低，這與Despina等[23]報道的2-茨醇嚴(yán)重抑制農(nóng)作物和雜草的種子萌發(fā)和植株生長的結(jié)果差異較大?？梢?，不同化合物的作用效果不僅與其自身的結(jié)構(gòu)特點、化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，還與被作用的物種有關(guān)。

與種子萌發(fā)相比，巨尾桉精油及其主要化合物對胚根生長的抑制作用更為嚴(yán)重，α-松油醇和α-松油醇乙酸萜烯在極低濃度下(2 μg·mL-1)便能完全抑制黃瓜胚根伸長，而α-蒎烯、1,8-桉葉素和2-茨醇也表現(xiàn)出了較強的抑制作用。這與牧草的胚根長度對黑芥菜、紫花苜蓿提取物較種子萌發(fā)更敏感[24-25]，與Despina等[23]的結(jié)果相似。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是單萜烯類化合物親脂性好，容易穿透線粒體膜，改變脫氫酶活性，從而損害呼吸代謝[26-27]；如1,8-桉葉素是一種有效的線粒體懸液吸氧抑制劑[28]，因此推測揮發(fā)油及其單萜類物質(zhì)通過抑制根系呼吸作用從而影響黃瓜根系發(fā)育[29]。

研究結(jié)果顯示，巨尾桉精油及其主要化合物對黃瓜種子萌發(fā)和胚根生長具有較強的化感作用，而這些精油或其化合物被土壤吸附轉(zhuǎn)運后，其抑制活性可保持?jǐn)?shù)月[30]，對林區(qū)及周邊地區(qū)的農(nóng)業(yè)發(fā)展造成一定制約，因此在巨尾桉生產(chǎn)區(qū)篩選不受其化感物質(zhì)影響的物種具有重要意義。