羅雯 賈莉 張佳文 王冬杰 孔英君

調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，2018年全球新發(fā)肺癌患者和死于肺癌的患者分別為2 093 876和1 761 007例，占所有惡性腫瘤的11.6%和18.4%，肺癌的發(fā)病率和死亡率均排在第一[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占所有肺癌的80%，臨床上約65%的患者在確診時(shí)已處于中晚期，NSCLC的5年生存率小于15%，但是關(guān)于NSCLC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制仍不清楚[2]。最新研究顯示自噬和腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)分化在腫瘤進(jìn)展中起著重要調(diào)控作用，NSCLC細(xì)胞的自噬和CSCs會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)展和化療敏感性降低[3-4]，關(guān)于腫瘤細(xì)胞自噬和CSCs的機(jī)制是現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種新型的非編碼RNA，由不帶有5′端帽和3′聚腺苷酸尾的外顯子mRNA或長非編碼RNA反向剪接形成的[5]。circRNA可以使微小RNA(microRNA，miRNA)海綿化失活，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因表達(dá)參與NSCLC的進(jìn)展[6]。有研究顯示，circABCB10在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)增加，下調(diào)circABCB10可促進(jìn)miR-1252表達(dá)并抑制FOXR2水平，從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖和遷移[7]。還有研究表明，hsa_circ_0020123在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，且被認(rèn)為與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良密切相關(guān)，hsa_circ_0020123可通過靶向結(jié)合miR-144上調(diào)ZEB1和EZH2，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[8]。本研究通過基因測(cè)序選定hsa_circ_0041198，由于hsa_circ_0041198是由MYO1C基因的部分外顯子環(huán)化而來，所以又稱為circRNA MYO1C。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析circRNA MYO1C對(duì)NSCLC自噬、CSCs和遷移的影響。希望通過本研究為提高NSCLC化療敏感性提供新的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而能讓目前困擾臨床的化療耐藥問題能有所突破。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B購自ATCC公司和肺癌細(xì)胞A549購自ATCC公司；96孔、24孔組織培養(yǎng)板購自康寧公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；Lipofectamine?2000(Invitrogen公司)；TRIzol試劑購自Aidlab公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；分光光度計(jì)；一抗anti-OCT4，anti-SOX2，anti-NANOG，anti-LC3，anti-P62，anti-GAPDH購自SANTA CRUZ公司；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，中國)；PVDF膜。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染

BEAS-2B和A549細(xì)胞均培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg/mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。

將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、NC組和siMYO1C組，NC組和si-MYO1C組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒和si-circRNA MYO1C質(zhì)粒，根據(jù)試劑盒說明書利用LipofectamineTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為7℃和5%CO2，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR：使用TRIzol從細(xì)胞中提取總RNA。RNA濃度和純度使用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量。將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA為模板，熒光定量PCR儀擴(kuò)增。通過比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參，最終數(shù)據(jù)以2-△△CT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將1×105個(gè)處理后細(xì)胞(150 μL)在96孔板中接種，分別在培養(yǎng)第24 h、48 h和72 h加入10 μL CCK-8試劑并在37℃下孵育顯色，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450nm下每孔吸光度(OD)值。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 在37℃下將細(xì)胞培養(yǎng)在無血清DMEM中，將細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理24 h。然后將細(xì)胞接種到24孔Transwell裝置的上部腔室中，將含有10%胎牛血清的DMEM充滿下部腔室。24 h后，清洗掉未侵入的細(xì)胞，并將滲透到下腔室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色5 min，光鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞在放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液中在冰上裂解并收集總蛋白。通過SDS-PAGE分離每個(gè)樣品中等量的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。通過在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h來封閉非特異性抗原。隨后，將膜與分別用封閉液稀釋的一抗(1∶200)在4℃下孵育過夜，然后將膜與山羊抗免IgG二抗(1∶1000)在室溫下孵育1 h。使用化學(xué)發(fā)光試劑顯示，使用BandScan分析膠片灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 circRNA MYO1C在肺癌中的表達(dá)特點(diǎn)

相對(duì)正常肺上皮細(xì)胞，circRNA MYO1C在A549細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)(0.99±0.06vs.4.87±0.88，t=7.597，P=0.002)(圖1)。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)人肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺癌細(xì)胞A549中circRNA MYO1C的表達(dá)水平Figure 1 The levels of circRNA MYO1C in BEAS-2B and lung cancer A549 cells were detected by RT-qPCRNote：**P<0.01，when compared with BEAS-2B cells.

2.2 各組細(xì)胞中circRNA MYO1C的水平

通過檢測(cè)對(duì)照組、NC組和siMYO1C組中circRNA MYO1C水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示干擾circRNA MYO1C后，與對(duì)照組及NC組比較，circRNA MYO1C在A549中表達(dá)顯著降低(1.07±0.12，1.05±0.25vs.0.22±0.04，F(xiàn)=27.238，P<0.001)(圖2)。選取NC組和siMYO1C組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中circRNA MYO1C的表達(dá)水平Figure 2 The levels of circRNA MYO1C in the control，NC and siMYO1C groups were detected by RT-qPCRNote：***P<0.001，when compared with the control and NC groups.

2.3 干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞生長的影響

結(jié)果顯示與NC組比較，siMYO1C組細(xì)胞培養(yǎng)第3天的OD值顯著低于對(duì)照組(P<0.001)(圖3)。

圖3 CCK-8法檢測(cè)干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞生長的影響Figure 3 The effect of interfering circRNA MYO1C on lung cancer cell proliferationNote：***P<0.001，when compared with NC group.

2.4 干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響

相對(duì)NC組，干擾circRNA MYO1C后顯著抑制了A549細(xì)胞的遷移(t=-34.154，P<0.001)(圖4)。

圖4 Transwell檢測(cè)干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響(200×)Figure 4 The effect of interfering circRNA MYO1C on the migration ability of lung cancer cells(200×)Note：***P<0.001，when compared with the NC group.

2.5 干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞CSC的影響

通過檢測(cè)CSCs標(biāo)志蛋白分析circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞CSCs的影響。相對(duì)NC組，干擾circRNA MYO1C后細(xì)胞中OCT4、SOX2和NANOG蛋白水平顯著降低，siMYO1C組的CSCs顯著低于NC組(t=-48.143，P<0.001；t=-31.846，P<0.001；t=-29.721，P<0.001)(圖5)。

圖5 Western blot檢測(cè)干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞CSC的影響Figure 5 The effect of interfering circRNA MYO1C on CSC in lung cancer cellsNote：***P<0.001，when compared with NC group.

2.6 干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞自噬水平的影響

通過檢測(cè)自噬底物標(biāo)志蛋白P62和自噬小體形成標(biāo)志蛋白IC3II/LC3I來評(píng)估細(xì)胞自噬水平。

結(jié)果顯示與NC組比較，siMYO1C組的IC3II/LC3I水平明顯降低，而P62水平升高(t=-39.240，P<0.001；t=51.385，P<0.001)(圖6)。

圖6 Western blot檢測(cè)干擾circRNA MYO1C對(duì)肺癌細(xì)胞自噬水平的影響Figure 6 The effect of interfering circRNA MYO1C on protein expression related to autophagy in lung cancer cellsNote：***P<0.001，when compared with NC group.

3 討論

CSCs作為腫瘤細(xì)胞群體中一種異質(zhì)性的細(xì)胞對(duì)腫瘤的生長和維持具有重要意義。CSCs除了具有和腫瘤細(xì)胞相似的特征，如細(xì)胞遷移、抗凋亡、放化療抵抗外，CSCs還展現(xiàn)了和干細(xì)胞相似的自我更新和多向分化潛能，同時(shí)CSCs可表達(dá)特異性標(biāo)記蛋白OCT3/4、Nestin、NANOG、CD44、CD24、CD133等[9]。其中作為轉(zhuǎn)錄因子的OCT4賦予了CSCs多向分化和自我更新的潛能[10]；而CD44和CD133表達(dá)可增加腫瘤化療耐藥[11]。關(guān)于CSCs起源目前公認(rèn)的有三種：CSCs起源于干細(xì)胞，CSCs起源于祖細(xì)胞，CSCs起源于細(xì)胞去分化。去分化理論認(rèn)為原癌基因突變導(dǎo)致了細(xì)胞去分化，即在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞去分化成CSCs，這一過程牽涉到對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致干細(xì)胞樣表型的獲得和CSCs的形成。TGF-β、Wnt、Hedgehog(Hh)、β-catenin、Notch、NFκB和STAT3等信號(hào)通路參與到了對(duì)CSCs分化的調(diào)控[12]。除此之外，自噬對(duì)CSCs分化也起到了重要調(diào)控作用，但具體機(jī)制尚不清楚[13]。

自噬是一個(gè)高度保守的自我降解過程，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和生存中起著關(guān)鍵作用。最近的研究已經(jīng)開始探索自噬在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用，鑒于目前缺乏有效的治療方法來治療轉(zhuǎn)移性疾病，這一點(diǎn)尤其值得關(guān)注。已有研究證實(shí)自噬參與了腫瘤的侵襲和化療耐藥過程[14]。自噬作為維持正常組織干細(xì)胞和CSCs干性的必要條件，在過去幾年中被廣泛研究。自噬促進(jìn)干細(xì)胞形成的機(jī)制以及為什么干細(xì)胞比非干細(xì)胞更依賴自噬是許多實(shí)驗(yàn)室正在研究的熱點(diǎn)。在正常的組織干細(xì)胞中，自噬可通過控制氧化應(yīng)激反應(yīng)來向神經(jīng)干細(xì)胞提供代謝物，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[15]；對(duì)于腫瘤，自噬隨著腫瘤惡性程度增加而上調(diào)，抑制自噬激活在很大程度上可增加腫瘤化療敏感性[16]；抑制CSCs分化也同樣可增加腫瘤化療敏感性，提示自噬可通過CSCs來影響腫瘤患者預(yù)后。且很多文獻(xiàn)也已經(jīng)證實(shí)自噬對(duì)CSCs分化具有促進(jìn)作用[17]。

除了自噬，越來越多的研究還發(fā)現(xiàn)非編碼RNA對(duì)腫瘤化療耐藥起重要調(diào)控作用，circRNA是一種非編碼RNA，在真核生物中的前體mRNA反向剪接過程中，通過3′和5′末端共價(jià)連接形成一個(gè)閉合的連續(xù)環(huán)[18]。circRNA上有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可通過吸附miRNA來調(diào)控mRNA表達(dá)并影響生物學(xué)功能，因此circRNA也被稱為“miRNA分子海綿”[19]。相關(guān)研究顯示，circABCB10在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)增加，下調(diào)circABCB10可促進(jìn)miR-1252表達(dá)并抑制FOXR2水平，從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖和遷移[20]。最近一項(xiàng)研究表明，hsa_circ_0020123在NSCLC中表達(dá)上調(diào)，且被認(rèn)為與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后不良密切相關(guān)，hsa_circ_0020123可通過靶向結(jié)合miR-144上調(diào)ZEB1和EZH2，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[21]。雖然circRNA在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等惡性表型的多個(gè)方面發(fā)揮著重要作用，但是其在腫瘤耐藥性調(diào)節(jié)方面的機(jī)制研究還不深入。本研究通過基因測(cè)序選定的hsa_circ_0041198，是由MYO1C基因的部分外顯子環(huán)化而來，所以稱為circRNA MYO1C。本次研究首先發(fā)現(xiàn)了circRNA MYO1C在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞中比正常肺上皮細(xì)胞明顯升高。并且進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示降低circRNA MYO1C的水平后，A549細(xì)胞的增殖和遷移的水平也顯著降低。

miRNA是真核細(xì)胞中一類非編碼的小RNA，在進(jìn)化上具有保守性，通過結(jié)合靶mRNA的3′-UTR參與轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控[22]，在腫瘤生物學(xué)中扮演著重要的作用。研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化中，miR-129-5p抑制上皮細(xì)胞自噬[23]，同時(shí)，其他報(bào)道也顯示miR-129-5p介導(dǎo)自噬[24]。另有研究顯示，miR-30a可以通過降低beclin 1介導(dǎo)的自噬作用，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[25]，提示可通過上調(diào)miR-30a的表達(dá)水平提高癌癥化療的療效。此外，miR-489在大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞和幾種耐藥乳腺癌細(xì)胞系中下調(diào)，而miR-489直接靶向自噬激活激酶1(ULK1)和溶酶體蛋白跨膜4β(LAPTM4β)，從而介導(dǎo)自噬抑制，是阿霉素致敏的主要機(jī)制[26]。

當(dāng)前的研究顯示miRNA的表達(dá)譜在耐藥和不耐藥腫瘤里表達(dá)不同。miRNA在腫瘤耐藥方面發(fā)揮多種調(diào)控作用，因此，針對(duì)miRNA的新型治療藥物的發(fā)現(xiàn)有望為未來的癌癥治療帶來希望。研究顯示，過表達(dá)miR-195可顯著降低抗凋亡蛋白Bcl-w的表達(dá)水平，提高肝癌對(duì)5-FU的敏感性[27]。項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn)miR-296-3p可通過靶向抑制CX3CR1來提高NSCLC的化療敏感性[28]。此外，miR-216b在肝癌中介導(dǎo)自噬，它的上調(diào)抑制自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-II的表達(dá)，通過HIF-2α-MALAT1-miR-216b軸調(diào)控肝癌的多重耐藥性[29]。

根據(jù)研究報(bào)道，miR-147b可逆轉(zhuǎn)EMT，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，且能逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物吉非替尼的耐藥性[30]。此外，miR-147b在結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào)，過表達(dá)miR-147b降低了結(jié)腸癌細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)miR-147b通過Wnt/β-Catenin通路抑制EMT，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌干細(xì)胞化[31]。研究發(fā)現(xiàn)miR-147b在HCC細(xì)胞系和原發(fā)性肝癌組織中均下調(diào)，HOXC6是miR-147b的下游靶點(diǎn)，過表達(dá)miR-147b抑制了HOXC6表達(dá)，顯著抑制肝癌在體外的增殖和遷移，并增加對(duì)5-FU化療敏感性，降低體內(nèi)致瘤性[32]。這表明miR-147b可以作為逆轉(zhuǎn)和預(yù)防肺癌耐藥性的潛在靶點(diǎn)[33]。下一步可對(duì)circRNA MYO1C與miR-147b間具有怎樣的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行研究證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示在干擾circRNA MYO1C后，細(xì)胞中OCT4、SOX2、NANOG和IC3II/LC3I水平蛋白水平顯著降低，而P62水平升高。本研究首次揭示了circRNA MYO1C促進(jìn)NSCLC細(xì)胞生長和遷移的功能，此外，circRNA MYO1C還參與了CSCs和自噬調(diào)控，這可能與NSCLC的轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)。

綜上所述，下調(diào)circRNA MYO1C能夠抑制NSLCLC細(xì)胞的CSCs分化和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，并抑制肺癌細(xì)胞遷移。本研究為提高NSCLC化療敏感性提供新的作用靶點(diǎn)，希望進(jìn)而能讓目前困擾臨床的化療耐藥問題能有所突破。