鄭 倩，周曉慧，王怡方，周曉瑩

（廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，南寧 530021）

腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一[1]。RCC可分為腎透明細(xì)胞癌（kidney clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney papillary cell carcinoma，KICH）和腎嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe，KIRP）等亞型，其中以KIRC 最為常見，占腎細(xì)胞癌死亡人數(shù)75%[2]。局部腎細(xì)胞癌可以通過腎切除和立體定向消融放療來治療，但是仍有30%的患者最終發(fā)生轉(zhuǎn)移，其中KIRC 在轉(zhuǎn)移性腎癌中占83%～88%。盡管基 于VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）和雷帕霉素（mamalian target of rapamycin，MTOR）等分子靶向藥物已經(jīng)應(yīng)用于腎細(xì)胞癌的臨床治療，但是對于大多數(shù)具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的效果卻微乎其微[3-4]。因此，找尋新的腎細(xì)胞癌生物分子標(biāo)志物對于疾病診斷、預(yù)后的判斷、制定精準(zhǔn)的治療方案具有重要的意義。

CDH13基因位于染色體16q14.2-3，編碼T-鈣粘蛋白（T-cadherin，T-cad），是鈣粘蛋白家族的成員之一。越來越多的研究表明，T-cad的下調(diào)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，如胃癌、膀胱癌、前列腺癌等，推測T-cad 可能是一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子[5-7]，但在KIRC中的研究尚未見報道。本文主要探索CDH13 在KIRC中的轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)改變和調(diào)控機制，及其作為預(yù)后標(biāo)志物的價值，以期為臨床治療KIRC 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫 利用UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（https://xena.ucsc.edu/）下載TCGA 數(shù)據(jù)庫分析533例KIRC組織和72例正常腎組織RNA-Seq數(shù)據(jù)，分析CDH13 在KIRC 中的轉(zhuǎn)錄水平及與患者臨床病例特征之間的相關(guān)性。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫 從NCBI中的GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）搜索KIRC 相關(guān)的表達(dá)譜芯片，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）至少包含KIRC 組織和非癌組織各3 例；（2）來源物種為人類；（3）包含CDH13的數(shù)據(jù)，由此共納入13套表達(dá)譜芯片，包含476 例KIRC 組織和312 例正常腎組織，對CDH13 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行Meta分析。

1.3 分析CDH13 在KIRC 啟動子區(qū)甲基化水平與患者生存時間之間的關(guān)聯(lián) 使用UALCAN 網(wǎng)頁（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）分別對CDH13蛋白表達(dá)和DNA 甲基化水平進行分析。利用SMART 在線分析網(wǎng)頁（http://www.bioinfo-zs.com/smartapp），確定CDH13啟動子區(qū)CpG島在KIRC中的甲基化修飾水平。通過MethSurv 在線甲基化分析網(wǎng)頁（https://biit.cs.ut.ee/methsurv/）分析CDH13在KIRC啟動子區(qū)甲基化水平與患者生存時間之間的關(guān)聯(lián)。

1.4 細(xì)胞及培養(yǎng)

人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)498（貨號CL-0254）購于武漢普諾賽生命科技有限公司，Caki-2 置于液氮中長期保存，分別使用DMEM和5A培養(yǎng)基（均含有10%的澳洲胎牛血清和1%的青鏈霉素混合液）中進行培養(yǎng)。利用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷（5-aza-dC）處理腎癌細(xì)胞系，將處于對數(shù)生長期的A498和Caki-2細(xì)胞接種與6孔板中，使用DMSO配制5-aza-dC 工作液濃度為5 μmol/L，連續(xù)處理4 d，對照組細(xì)胞則用DMSO處理。

1.5 實時熒光定量PCR檢測CDH13轉(zhuǎn)錄水平

腎癌cDNA芯片購自上海芯超生物科技有限公司，其cDNA 芯片（cDNA-HKidE030CS01）包含15例KIRC組織和匹配的鄰近組織。通過實時熒光定量PCR 對15 例KIRC 組織樣本與15 例匹配的癌旁組織樣本，利用SYBR Green 定量試劑盒，在Quant-Studio 5 Flex Real-time PCR系統(tǒng)使用Q-PCR反應(yīng)檢測CDH13 mRNA 表達(dá)水平，實驗采用20 μL 體系，包括SYBR 10 μL，去離子水7 μL，正反向引物和cDNA各1 μL構(gòu)成。PCR擴增程序：95 ℃（預(yù)變性）10 min；95 ℃10 s，60 ℃1 min 共40 個循環(huán)。采用Ct（2-ΔΔCt）法方法計算CDH13 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。引物序列（5'～3'）：CDH13-Forward：AGAAAGGTCCAAGTTCCGGC，CDH13-Reverse：ACTTCTCTGTCCAAGGTCCGT；GAPDH-Forward：AAGCTCACTGGCATGGCCTT，GAPDH-Reverse：CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均為計量資料，數(shù)據(jù)間使用兩兩獨立樣本t檢驗進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，利用stataSE-64 12.0統(tǒng)計軟件進行Meta分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDH13 在KIRC 中的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)改變 CDH13在KIRC患者中的轉(zhuǎn)錄水平較正常對照組織上調(diào)（P＜0.05），見表1。Meta 分析顯示KIRC 組織CDH13 mRNA 水平高于正常組織（P＜0.05），與TCGA 數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。森林圖顯示CDH13 在KIRC 中的表達(dá)研究存在異質(zhì)性（I2=85.6%，P=0.000）（圖1 A），使用隨機效應(yīng)模型進行分析，95%置信區(qū)間CI：1.57～2.51（P=0.000）（圖1B），Beggar’s 漏斗圖法顯示發(fā)表性存在發(fā)表偏倚（P＜0.05）（圖1C）。

KIRC組織中CDH13轉(zhuǎn)錄水平較正常組織明顯升高（P=0.012）（圖1D），與生物信息分析結(jié)果一致。利用UALCAN網(wǎng)頁中CPTAC數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)CDH13 蛋白表達(dá)水平在KIRC 組織（n=110）較正常組織（n=84）中明顯上調(diào)（P＜0.05，圖1E）。

圖1 CDH13在KIRC中的mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)改變

2.2 CDH13 在KIRC 中的mRNA 和蛋白表達(dá)與臨床特征的相關(guān)性 CDH13的轉(zhuǎn)錄水平在伴有淋巴、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的KIRC患者中顯著低于無轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），見表1。表1 結(jié)果提示CDH13 mRNA表達(dá)水平與KIRC 的疾病進程密切相關(guān)。此外，CDH13 的蛋白水平在Ⅰ～Ⅳ期的KIRC 中均顯著高于正常組織（P＜0.05），但隨著分期越高，CDH13表達(dá)則有下降趨勢（圖2A），CDH13 的蛋白水平雖然較正常組織升高，但隨著臨床分級的不斷發(fā)展，其蛋白變化不明顯（圖2A），卻隨著腫瘤分級的程度的不斷惡化而逐漸降低（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 CDH13在KIRC中蛋白表達(dá)水平與臨床特征之間的關(guān)系

表1 CDH13 在KIRC 中mRNA 表達(dá)水平及其與臨床病特征的關(guān)系

表1 CDH13 在KIRC 中mRNA 表達(dá)水平及其與臨床病特征的關(guān)系

2.3 KIRC中CDH13啟動子區(qū)甲基化水平

KIRC組織中CDH13啟動子區(qū)甲基化水平較正常組織升高（P＜0.001）；通過SMART網(wǎng)頁對CDH13 在KIRC 中啟動子區(qū)含有CpG 島的位點進行篩選，得到6 個cg 位點，分別是cg08747377、cg05374412、cg00806490、cg08856946、cg09189772、cg09369556。通過對cg位點甲基化修飾分析，發(fā)現(xiàn)不同位點中CDH13 甲基化水平均在KIRC 中上調(diào)。為了驗證CDH13 啟動子區(qū)確實受到甲基化修飾的調(diào)控，使用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC 處理A498 與caki-2 兩株腎癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過5-aza-dC處理4 d 后，CDH13 的轉(zhuǎn)錄水平高于未經(jīng)處理組（P＜0.05），說明CDH13 的啟動子區(qū)確實受甲基化的調(diào)控，見圖3。

圖3 KIRC中CDH13啟動子區(qū)甲基化水平

2.4 CDH13甲基化水平與KIRC臨床特征的相關(guān)性

CDH13隨著臨床分期的升高，甲基化水平逐漸升高（P＜0.05）；此外，利用SMART 在線分析工具，對不同cg位點的甲基化水平進行分析，發(fā)現(xiàn)不同位點均隨著腫瘤分期的發(fā)展逐漸而升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 CDH13啟動子區(qū)甲基化修飾水平與KIRC臨床特征之間的關(guān)系

2.5 CDH13 mRNA和甲基化的預(yù)后分析 為進一步驗證其預(yù)后，利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中KIRC 患者的生存時間與CDH13的轉(zhuǎn)錄和甲基化水平進行分析，發(fā)現(xiàn)mRNA 轉(zhuǎn)錄水平中隨著CDH13 低表達(dá)患者生存時間明顯下降（圖5A），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。同時對啟動子區(qū)cg 位點的甲基化水平進行生存分析，發(fā)現(xiàn)5個cg位點隨著甲基化水平的升高，患者的生存時間明顯下降（P＜0.05）（圖5B～圖5F）。因此，CDH13可以作為轉(zhuǎn)移性KIRC預(yù)后的有效分子標(biāo)志物。

圖5 CDH13表達(dá)和甲基化在KIRC中的預(yù)后相關(guān)性分析

3 討論

研究表明，CDH13通過細(xì)胞—細(xì)胞黏附和整合素介導(dǎo)的細(xì)胞—基質(zhì)接觸之間的交叉作用調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。其與腫瘤的發(fā)展，尤其是在侵襲與轉(zhuǎn)移過程可以作為重要的抑制因子[5]，CDH13的高表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路，通過上調(diào)CDH1、下調(diào)VIM、MMP-2 的表達(dá)影響胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。此外，在口腔癌中CDH13表達(dá)下調(diào)可激活PI3K/AKT/mTOR 途徑促進癌細(xì)胞的增殖[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，CDH13 隨著KIRC 患者病程的發(fā)展逐步表達(dá)下調(diào)，有淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的患者較無轉(zhuǎn)移的患者，其轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均降低，提示CDH13的下調(diào)可能參與KIRC的轉(zhuǎn)移。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CDH13 基因DNA 啟動子區(qū)在KIRC 中呈高甲基化，同時啟動子區(qū)含有CpG 島的cg位點也呈現(xiàn)高甲基化，并隨著腫瘤發(fā)展而逐步增高，利用去甲基化藥物5-aza-dC 處理后可恢復(fù)CDH13的表達(dá)，進一步驗證了CDH13在KIRC中受DNA 甲基化修飾的調(diào)控。表觀遺傳學(xué)在腫瘤中的作用一直是研究的熱點，尤其是啟動子區(qū)的高甲基化導(dǎo)致基因的轉(zhuǎn)錄沉默。在許多研究中，CDH13高甲基化在許多腫瘤中被報道，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等[5,7,11]。作為一種腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的抑制因子，CDH13 異常高甲基化導(dǎo)致mRNA 水平明顯降低，與腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]，而調(diào)控腫瘤基因功能的主要機制之一是啟動子區(qū)域的異常甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)。Shenog 等[4]發(fā)現(xiàn)，CDH13啟動子異常甲基化在結(jié)直腸癌中通過下調(diào)其表達(dá)在發(fā)病機制中起重要作用。在乳腺癌和肺癌中，Polβ（DNA polymerase β）的過表達(dá)可抑制腫瘤，而DNA 去甲基化可促進CDH13 轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)從而誘導(dǎo)Polβ 的表達(dá)，進而抑制腫瘤的發(fā)展[13]。而本研究也證實CDH13 受DNA 甲基化調(diào)控，并可能參與KIRC的轉(zhuǎn)移，與上述研究結(jié)論相符。

CDH家族有較多成員在KIRC中轉(zhuǎn)錄和表達(dá)異常，與腫瘤的分期和分級密切相關(guān)，并可以預(yù)測KIRC患者的預(yù)后情況[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CDH4 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在KIRC 的發(fā)展進程中逐漸下調(diào)，并且與晚期轉(zhuǎn)移的KIRC 患者的CDH4 的轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)，提示CDH4 可作為KIRC 的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物[15]。此外，miR-27a-3p 靶向調(diào)控CDH5 的表達(dá)，使其在KIRC 的腫瘤分期和轉(zhuǎn)移中轉(zhuǎn)錄水平下降，并且CDH5 低表達(dá)與KIRC 患者的生存及預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系，說明miR-27a-3p作為KIRC 的診斷標(biāo)志物[16]。在本研究中，CDH13 在腫瘤發(fā)展進程其甲基化水平逐漸升高，導(dǎo)致KIRC 中CDH13 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平逐漸降低，提示其在KIRC 中的分期、分級和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中可能受到廣泛的甲基化修飾，且低表達(dá)CDH13的腎細(xì)胞癌患者生存時間降低，預(yù)后效果差。因此，CDH13 的表達(dá)在轉(zhuǎn)移性KIRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，本研究的結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)CDH13 在KIRC 中由于受到DNA 高甲基化調(diào)控，隨著疾病的進展，其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平進一步失活，且通過轉(zhuǎn)移性KIRC 患者的CDH13 轉(zhuǎn)錄水平可評估其預(yù)后效果。因此，CDH13 可能是轉(zhuǎn)移性KIRC 潛在的預(yù)后標(biāo)志物，為腎細(xì)胞癌的預(yù)后評價提供新研究的方向。