王婷 吳東芝 武雪

摘要 [目的]基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析川芎嗪治療增生性瘢痕的分子機(jī)制。 [方法]獲取臨床手術(shù)的增生性瘢痕組織，利用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)分離瘢痕成纖維細(xì)胞，分為對照組和川芎嗪組（10 mg/mL）。采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)及 GO、KEGG 通路富集分析，研究增生性瘢痕成纖維細(xì)胞各基因的表達(dá)。 [結(jié)果]轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果得到川芎嗪參與調(diào)控2 783個(gè)差異基因，GO及 KEGG 通路富集分析顯示以上基因主要富集于DNA復(fù)制，細(xì)胞周期，類固醇生物合成錯(cuò)配修復(fù)，p53信號通路，蛋白質(zhì)的消化吸收，不飽和脂肪酸的生物合成等通路。[結(jié)論]該研究揭示調(diào)控成纖維細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控蛋白，對闡明川芎嗪防治增生性瘢痕的具體作用機(jī)制提供了重要信息。

關(guān)鍵詞 川芎嗪;轉(zhuǎn)錄組;高通量測序;增生性瘢痕

中圖分類號 R 285? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）23-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.036

The Mechanism of Tetramethylpyrazine in Improving Hypertrophic Scar Based on Transcriptomics

WANG Ting1，WU Dong-zhi2，WU Xue2

（1.College of Pharmacy，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000;2.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712000）

Abstract [Objective]The molecular mechanism of tetramethylpyrazine in the treatment of hypertrophic scar was analyzed based on transcriptomics.[Method]Hypertrophic scar tissue from clinical operation was obtained，and scar fibroblasts were cultured and separated by tissue block culture method，and divided into control group and tetramethylpyrazine group （10 mg/mL）.Transcriptome sequencing technology and GO KEGG pathway enrichment analysis were used to study the gene expression of hypertrophic scar fibroblasts.[Result]Transcriptome analysis showed that tetramethylpyrazine was involved in the regulation of 2 783 differential genes，and enrichment analysis of GO and KEGG pathways showed that the above genes were mainly concentrated in DNA replication，cell cycle，steroid biosynthesis mismatch repair，p53 signaling pathway，protein digestion and absorption，unsaturated fatty acid biosynthesis and other pathways.[Conclusion]This study reveals the related regulatory proteins that regulate fibroblasts and provides important information for clarifying the specific mechanism of tetramethylpyrazine in preventing and treating hypertrophic scar.

Key words Tetramethylpyrazine;Transcriptomics;High-throughput sequencing;Hypertrophic scar

基金項(xiàng)目 教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（18JK0212）。

作者簡介 王婷（1996—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：抗結(jié)腸癌藥物。通信作者，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事增生性瘢痕的防治和發(fā)生機(jī)制研究。

收稿日期 2021-06-01

增生性瘢痕是皮膚燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，每年新增患者達(dá)數(shù)百萬[1]。作為一種嚴(yán)重的皮膚纖維化疾病，不僅影響美觀，危害患者的生理和心理健康，甚至?xí)饑?yán)重的功能障礙，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。盡管臨床上有多種治療方案，但因增生性瘢痕的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率高及治療周期長等特點(diǎn)，加之目前缺乏預(yù)防瘢痕形成及改善瘢痕的特效藥物。因此，增生性瘢痕是臨床治療面臨的一大難題，成為國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前認(rèn)為增生性瘢痕的形成主要與遺傳因素、創(chuàng)面炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子的作用、膠原代謝失衡和成纖維細(xì)胞的功能失調(diào)密切相關(guān)[2]。其中，成纖維細(xì)胞的作用至關(guān)重要。成纖維細(xì)胞和由其表型轉(zhuǎn)化而來的肌成纖維細(xì)胞直接參與皮膚損傷后創(chuàng)面愈合，是多種細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)作用的靶細(xì)胞，更是導(dǎo)致膠原代謝失衡和瘢痕形成的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞[2-3]。

川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP）是從中藥川芎中提取得到的活性單體，研究表明川芎嗪可明顯改善心肌、肺和肝纖維化等纖維化疾病[4]。Wu等[5]已經(jīng)證實(shí)了川芎嗪通過調(diào)節(jié)膠原的表達(dá)和細(xì)胞的增殖與凋亡，從而抑制瘢痕成纖維細(xì)胞纖維化，拮抗瘢痕的增生。鑒于中藥復(fù)方成分多以及作用的復(fù)雜性，川芎嗪拮抗瘢痕成纖維細(xì)胞纖維化的其余機(jī)制研究尚不明確，有待深入研究。該研究采用轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq） 技術(shù)分析川芎嗪干預(yù)瘢痕成纖維細(xì)胞的差異表達(dá)基因，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平進(jìn)一步揭示調(diào)控成纖維細(xì)胞的相關(guān)調(diào)控蛋白，以期闡明川芎嗪防治增生性瘢痕的具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本 增生性瘢痕組織均來自空軍軍醫(yī)大學(xué)燒傷與皮膚外科即將接受手術(shù)的成年患者（20 ～ 44歲）。在試驗(yàn)前，所有患者均有知情同意書，所有方案均由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬西京醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 瘢痕成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

組織塊經(jīng)消毒、清洗，置于0.25% Dispase中，4 ℃消化12 h，分離真皮層，洗滌后剪切成0.1～1.0 mm的組織塊，接種于培養(yǎng)瓶中，傳至2～4代的成纖維細(xì)胞凍存于液氮罐中保存，試驗(yàn)用5～8代細(xì)胞。

1.3 分組及給藥

將體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，待細(xì)胞80%融合時(shí)用無血清培養(yǎng)基孵育12 h后，加入川芎嗪（40 μmol/L）處理24 h后收集細(xì)胞樣本用于后續(xù)檢測。

川芎嗪購自上海源業(yè)生物科技有限公司，純度98%。取10 mg TMP溶液稱重，溶解于1 mL DMSO中，制成10 mg/mL川芎嗪溶液。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測 收集瘢痕成纖維細(xì)胞和川芎嗪處理后的瘢痕成纖維細(xì)胞樣本，使用RNAprep試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，用含有寡糖（dT）的小球從總RNA中分離poly mRNA，去除rRNA。采用illumina Hiseq測序平臺的雙端測序模式對多個(gè)樣本進(jìn)行高通量測序，去除單細(xì)胞SMARTER建庫接頭，根據(jù)illumina測序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于末端的分布特點(diǎn)，利用Skewer軟件對測序數(shù)據(jù)從3′端動(dòng)態(tài)去除和接頭序列片段和低質(zhì)量片段，利用FastQC軟件對預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析，利用FastQC軟件對預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析以及Q20、Q30堿基比例統(tǒng)計(jì)。

1.5 差異基因篩選及分析 利用DESeq2軟件對不同樣本組之間篩選差異表達(dá)的已知基因，滿足|log2FC|≥1和P≤0.05差異表達(dá)范圍，篩選2組之間的差異基因。

1.6 GO 和 KEGG 功能分析和富集分析

針對目的基因集采用TopGO軟件進(jìn)行GO功能分析，GO功能富積分析的方法：將全部基因作為背景列表，目的基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表，利用Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算代表GO功能集在目的基因列表中是否顯著富積的P值，再對P值經(jīng)Benjamini & Hochberg多重檢驗(yàn)糾正后得到FDR。KEGG pathway功能分析是針對這些基因進(jìn)行KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway的功能注釋和歸類，KEGG pathway功能富積分析方法與GO功能富積分析類似。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)差異 將對照組與川芎嗪處理組的各基因表達(dá)情況進(jìn)行對比，結(jié)果表明，川芎嗪組共致使2 783個(gè)基因表達(dá)水平存在顯著變化，其中使表達(dá)水平顯著上調(diào)的基因有1 285個(gè)，顯著下調(diào)的基因有 1 498 個(gè)（P<0.01）。

用 R 語言 ggplots2 軟件包繪制差異表達(dá)基因的火山圖，火山圖展示2分組之間基因表達(dá)倍數(shù)差異和顯著性程度（圖1），綠色是相對對照組顯著性下調(diào)的基因（即P≤0.05，foldchange≥2），紅色點(diǎn)則為上調(diào)基因。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，得到川芎嗪處理后修復(fù)增生性瘢痕密切相關(guān)的基因，分別列舉了處理組與對照組高表達(dá)和低表達(dá)的5個(gè)基因（表1）。

2.2 GO 富集 Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫是用專業(yè)術(shù)語對基因產(chǎn)物的屬性進(jìn)行定義。GO包括3個(gè)本體，用來描述細(xì)胞學(xué)組分、分子功能和參與的生物學(xué)過程（圖2）。差異表達(dá)基因的GO分析結(jié)果顯示，這些差異基因分別涉及20條生物學(xué)過程，主要影響細(xì)胞周期、染色體分離、有絲分裂、核分裂、細(xì)胞器裂變、DNA代謝過程、DNA復(fù)制等，20條細(xì)胞學(xué)組分為染色體分離，染色體著絲粒區(qū)域等相關(guān)組分，20 條分子功能主要涉及單鏈DNA依賴的ATP酶活性，DNA二級結(jié)構(gòu)結(jié)合以及細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成成分等。

2.3 KEGG 富集 該研究通過 KEGG pathway 顯著性富集分析來篩選對照組和川芎嗪干預(yù)組間的差異基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以 KEGG pathway 為單位，通過超幾何檢驗(yàn)，篩選出與整個(gè)基因組相比后差異表達(dá)基因顯著富集的pathway，以Q<0.05 的pathway 定義為各組差異表達(dá)基因顯著富集的 pathway。從復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度，找出與增生性瘢痕相關(guān)的KEGG 通路，從而提取出相關(guān)KEGG 通路中的差異表達(dá)基因。KEGG 富集結(jié)果見圖3，這些差異基因被富集于DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、類固醇生物合成錯(cuò)配修復(fù)、p53信號通路、蛋白質(zhì)的消化吸收、不飽和脂肪酸的生物合成等通路上。

3 討論

增生性瘢痕是燒傷、創(chuàng)傷等皮膚損傷后的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。瘢痕與正常皮膚相比，表面呈紅色，局部增厚變硬，嚴(yán)重影響患者外觀并引發(fā)功能性障礙，給患者心理、生理帶來巨大的困擾[6-7]。增生性瘢痕的主要病理特征包括成纖維細(xì)胞過度增殖、毛細(xì)血管增生以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。其發(fā)生的誘因主要有燙傷、燒傷及創(chuàng)傷等皮膚深度損傷，創(chuàng)面愈合時(shí)間延長，過度的炎癥反應(yīng)及遺傳因素等。因此，抑制成纖維細(xì)胞的過度增殖、激活成纖維細(xì)胞凋亡、減少基于膠原的ECM沉積對增生性瘢痕治療至關(guān)重要。其中，成纖維細(xì)胞被賦予完整的機(jī)制，允許ECM的沉積和吸收，在穩(wěn)態(tài)條件下不斷更新[8]。

該研究通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)分析了川芎嗪治療組與對照組瘢痕成纖維細(xì)胞的差異表達(dá)基因，隨后對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GO分析和富集分析。研究結(jié)果表明，川芎嗪治療后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的基因發(fā)生了明顯改變，統(tǒng)計(jì)分析有2 783個(gè)基因發(fā)生明顯變化，其中顯著上調(diào)的基因有1 285個(gè)，顯著下調(diào)的基因有1 498個(gè)。研究表明[9]，在疤痕中角蛋白16（keratin 16）數(shù)量極少或不存在，該研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，川芎嗪處理組中的keratin 16表達(dá)明顯上調(diào)。當(dāng)keratin 16的表達(dá)異常時(shí)，病變部位的皮膚屏障功能會(huì)受到不同程度的破壞，未受累皮膚的屏障功能也會(huì)受到影響，不僅皮膚滲透屏障功能受到影響，還會(huì)引起皮膚炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體受到進(jìn)一步損害[10]。Meyer等[11]研究表明，角質(zhì)形成細(xì)胞中的成纖維細(xì)胞生長因子3型受體（FGFR3）對于小鼠皮膚發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和傷口修復(fù)不可或缺，經(jīng)川芎嗪處理后的瘢痕成纖維細(xì)胞與對照組相比FGFR3表達(dá)量上調(diào)2.39倍（P≤0.05）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)FGFR1、FGFR2和FGFR3共同作用，能維持表皮完整性和皮膚穩(wěn)態(tài)。Joannes等[12]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF18可抑制成纖維細(xì)胞的細(xì)胞生長，結(jié)果顯示川芎嗪處理組瘢痕成纖維細(xì)胞中FGF18與對照組相比上調(diào)了1.52倍（P≤0.05）。白細(xì)胞介素15（IL-15）為一種細(xì)胞生長因子，也可以作為一種化學(xué)引誘因子，并具有促炎特性。Teich-Alasia等[13]研究證明，從活躍期增生性瘢痕到緩解期增生性瘢痕的進(jìn)展是由IL-15的減少而引起的活化浸潤性T細(xì)胞的活性或被動(dòng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果。IL-15可富集、激活和防止活躍期增生性瘢痕中激活的T淋巴細(xì)胞凋亡，因此抑制IL-15的表達(dá)可緩解疤痕角質(zhì)層增厚。臨床前試驗(yàn)證明，抗IL-20RA單克隆抗體[14]具有抑制化學(xué)藥物（四氯化碳）或機(jī)械膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的小鼠模型中TGF-β產(chǎn)生或ECM成分過度積累的效果，故下調(diào)IL-20RA表達(dá)可減少ECM積累。

該研究從整體上揭示了差異基因的功能、代謝途徑和信號通路，闡明了川芎嗪通過調(diào)控成纖維細(xì)胞增殖的相關(guān)基因表達(dá)水平來改善增生性瘢痕，為臨床治療增生性瘢痕提供了新思路。

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