陳二方 常會敏 安曉剛 邱建華 查定軍

摘要 [目的] 建立一種更適用于活體斑馬魚成像的固定方法，為活體斑馬魚成像研究提供技術支持。[方法]通過比較4種不同的斑馬魚體位固定方法及成像觀察效果，觀察不同固定方法的可操作性和成像觀察效果。[結果]使用6%甲基纖維素固定時，對斑馬魚進行拍照時容易產(chǎn)生擺動;使用0.05%MS-222固定時，斑馬魚很難保持合適的體位;使用1%的低熔點瓊脂糖，相對費時; 使用6%甲基纖維素/0.05%MS-222固定時，既可以使斑馬魚保持濕潤的環(huán)境，又可以保持理想的靜止狀態(tài)。[結論]通過比較4種固定方法發(fā)現(xiàn)，使用6%甲基纖維素/0.05%MS-222固定斑馬魚仔魚可操作性最好，該方法可為斑馬魚活體研究提供良好的活體成像觀察保障，有助于獲取高質(zhì)量的活體成像圖片。

關鍵詞 斑馬魚;活體成像;甲基纖維素;固定方法

中圖分類號 S 917.4? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）23-0124-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.23.033

A New Fixation Method for in vivo Imaging and Observation of Zebrafish

CHEN Er-fang1， CHANG Hui-min2， AN Xiao-gang1 et al

（1.Otolaryngology，Head and Neck Surgery， Xijing Hospital， PLA Air Force Military Medical University，Xi’an， Shaanxi 710032; 2. Department of Otolaryngology，Head and Neck Surgery，The First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University，Xi’an，Shaanxi 710077）

Abstract [Objective] To introduce a new fixation method for in vivo imaging of zebrafish， and provide technical supports for in vivo imaging research of zebrafish.[Method] Though comparing the position fixation methods and imaging observation effects of four different methods， the feasibility and imaging observation effects of different fixation methods were observed.[Result]6% methyl cellulose fixation method was used， it was easy to produce wobble in the process of taking pictures. When zebrafish was fixed with 0.05%MS-222， it was difficult to maintain the proper position.When 1% agarose with a low melting point was used， it was relatively time-consuming. When 6% methyl-cellulose /0.05%MS-222 were used for the fixation， it could not only keep zebrafish in a moist environment， but it could maintain an ideal static state. [Conclusion] By comparing four fixation methods， it was found that fixing zebrafish with 6% methylcellulose /0.05%MS-222 were the most maneuverable.This method could provide a good in vivo imaging observation guarantee for in vivo research of zebrafish， and it was helpful to obtain? in vivo imaging pictures with high-quality.

Key words Zebrafish;In vivo imaging;Methyl cellulose;Fixation method

基金項目 國家自然科學基金面上項目（81870732）;學科助推計劃-先進學科建設項目（XJZT18X23）。

作者簡介 陳二方（1984—），女，安徽宿州人，技師，碩士，從事耳聾的基礎研究。通信作者，教授，博士，從事耳科基礎與臨床研究。

收稿日期 2021-07-28

斑馬魚作為一種熱帶魚，胚胎發(fā)育速度快、養(yǎng)殖成本低、能大規(guī)模繁育[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚基因與人類基因的相似度在70%以上[4]，因此它受到生物學家的重視，已經(jīng)成為最受重視的脊椎動物發(fā)育生物學研究的動物模型之一[5]。目前全球范圍內(nèi)有超過1 500個斑馬魚實驗室，我國有300個以上的實驗室利用斑馬魚開展相關試驗[6]。

斑馬魚體表含有神經(jīng)丘毛細胞，同時內(nèi)耳也存在毛細胞，常被用于內(nèi)耳毛細胞損傷與保護的試驗研究中。但是，在斑馬魚動物模型造模過程中，對斑馬魚毛細胞進行特異性染料標記后發(fā)現(xiàn)，如何固定斑馬魚使其在激光共聚焦顯微鏡、體式顯微鏡下成像觀察及拍照、獲取高質(zhì)量的圖片尤為重要。筆者通過比較4種活體斑馬魚成像觀察的固定方法，嘗試找出一種最佳適用于活體斑馬魚成像觀察的固定方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

AB品系野生型斑馬魚在中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科全軍航空航天醫(yī)學內(nèi)耳研究重點實驗室養(yǎng)育，并進行繁育傳代;斑馬魚在28.5 ℃恒溫環(huán)境中生長，光照∶黑暗時間為14∶10，胚胎用胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)，養(yǎng)殖方法參照《Zebrafish Book》（http：//www.zfin.org）常規(guī)方法進行。

1.2 試驗材料與設備

試驗材料：甲基纖維素（M6385，Sigma）;苯基硫脲（P7629，Sigma）;低熔點瓊脂糖（A9414，Sigma）;乙基3-氨基苯甲酸酯甲烷磺酸鹽（MS-222，A5040）;氫氧化鈉購自天津市天力化學試劑有限公司;突觸素TMC4（FM1-43，Sigma，S6814）。主要設備：激光共聚焦顯微鏡（FV-1000，奧林巴斯，日本）;體式顯微鏡（M205 FA，萊卡，德國）;精密電子天平（Sartorius，德國）;GZX型光照培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)）;愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。

1.3 胚胎養(yǎng)殖

在交配前一晚，在交配盒中按照雌雄比1∶1或1∶2配魚（圖1）。交配當日，抽掉交配盒中間的隔離擋板，讓雌、雄魚互相追逐，產(chǎn)下胚胎，并收集胚胎。收集過程中去除死卵及糞便等，將胚胎置于胚胎培養(yǎng)液中，放置在28.5 ℃的光照培養(yǎng)箱中，待發(fā)育至24 hpf（hours post fertilization）時，換成0.003%的苯基硫脲（PTU）溶液，其作用是抑制黑色素形成，排除其對活體成像的干擾。

1.4 6%甲基纖維素/0.05% MS-222的配制

將MS-222配制成5%的儲存液，使用時濃度稀釋至0.05%。將140 mL 0.05% MS-222置于磁力攪拌器上加熱至沸騰，將12 g甲基纖維素緩慢加入，一邊加入一邊用玻璃棒攪拌，以促使其溶解，繼續(xù)攪拌3 min左右，直至甲基纖維素充分溶解分散，加入3～5滴5 moL/L的NaOH溶液，促使其溶解，在此期間繼續(xù)攪拌，此時溶液逐漸呈乳白色;將溶液和預先放置在冰箱冷藏室中的60 mL 0.05% MS-222充分混合、預冷，溶液顏色從乳白色變成半透明色，繼續(xù)將溶液放置在制冰機或者冷凍中，處理2 h左右，溶液變成透明的淡黃色。

1.5 FM1-43染色

首先將FM1-43配制成10 mg/mL的儲存液，避光冷凍儲存，使用時稀釋成濃度3 μmoL/L。將發(fā)育至5 dpf（days post fertilization）的斑馬魚仔魚，置于6孔板上，吸除斑馬魚養(yǎng)殖用水，加入5 mL 3 μmoL/L的FM1-43，避光染色10 min;最后，吸除染液，用斑馬魚養(yǎng)殖用水洗滌3次，每次10 min，采用不同的固定方法將仔魚固定在共聚焦培養(yǎng)皿或者凹玻片上，顯微鏡下成像觀察及拍照。

2 結果與分析

2.1 4種固定活體斑馬魚方法的比較

用一次性的巴氏吸

管將發(fā)育至5 dpf的斑馬魚仔魚從養(yǎng)殖盒中緩緩吸出，置于凹

玻片或共聚皿上，用濾紙條將多余的水分吸除。使用以下4種固定方法分別固定斑馬魚仔魚，見表1。①使用巴氏吸管將預先配制好的6%甲基纖維素滴在仔魚上，用牙探針或鑷子將斑馬魚調(diào)整至合適的成像體位。甲基纖維素具有一定的黏性，可使魚體擺放成特定的成像體位，但支撐力度欠缺，在拍照過程中會有輕微擺動，影響拍照效果。②使用移液器將0.05%MS-222吸出，滴加在仔魚上，用上述同樣方法調(diào)整體位，仔魚在麻醉劑的作用下保持靜止，但是由于缺乏支撐，很難將仔魚擺放成適合拍照的體位，且在拍照過程中，由于載物臺的移動，體位容易改變。③將配制的1%低熔點瓊脂糖冷卻至30 ℃以下后，用巴氏吸管吸出，滴在斑馬魚上，用工具調(diào)整好體位，等待瓊脂糖凝固。該方法的優(yōu)點是可以給仔魚提供適宜的濕度及支撐，缺點是此瓊脂糖在65 ℃左右會溶解，在26～30 ℃下會凝結，溫度不好控制。溫度過高時容易造成仔魚死亡，溫度過低時瓊脂糖凝結較快，不方便固定。④使用巴氏吸管將6%甲基纖維素/0.05%MS-222滴加在斑馬魚仔魚上，按照同樣方法調(diào)整體位。此方法不僅可快速固定斑馬魚仔魚，而且甲基纖維素提供的濕度可使仔魚存活相當長的時間。另外，MS-222可使仔魚麻醉，并保持靜止狀態(tài)，方便成像觀察及拍照記錄。通過比較上述4種固定方法發(fā)現(xiàn)，使用6%甲基纖維素/0.05%MS-22固定斑馬魚仔魚的方法更具優(yōu)勢，可操作性更強，更適用于活體斑馬魚成像觀察。

2.2 甲基纖維素/MS-222聯(lián)合固定仔魚結果

將斑馬魚仔魚包埋在含0.05%MS-222的6%甲基纖維素中，仔魚可在較長時間內(nèi)保持相同的姿勢，同時甲基纖維素也不會影響成像觀察及拍照視野。無論使用激光共聚焦拍照（圖2），還是使用體式顯微鏡拍照（圖3），均能取得較滿意的拍攝效果。

3 討論

近年來斑馬魚動物模型常被用于發(fā)育、毒理等方面的研究中[7-10]。由于斑馬魚具有與哺乳動物類似功能的內(nèi)耳結構，且其體表側線上分布著感受聲音、震動及水流等的神經(jīng)丘毛細胞，所以斑馬魚越來越受到耳科領域研究者的青睞。另外，斑馬魚毛細胞是可以再生的，且具有胚胎產(chǎn)量多、發(fā)育快等優(yōu)點，因此被越來越廣泛應用于內(nèi)耳毛細胞損傷及保護性藥物篩選中。Vlasits等[11]利用斑馬魚動物模型，從FDA批準的藥物庫中篩選出可以保護毛細胞免受順鉑和氨基糖苷類藥物損傷的化合物。Namdaran等[12]用新霉素損傷斑馬魚側線神經(jīng)丘，建立毛細胞損傷與再生模型，從1 680種化合物中篩選出地塞米松、強的松龍2種可以促進再生的化合物和氟苯達唑、拓撲替康等6種抑制再生的化合物。

然而，在斑馬魚動物模型造模成功后，如何對斑馬魚進行良好的體位固定，以便觀察成像及獲取理想的圖片成為研究學者亟待解決的問題。傳統(tǒng)固定活體斑馬魚的方法主要包括：①先用麻藥將魚麻醉，再用甲基纖維素固定[13];②單純使用魚麻醉劑（MS-222）麻醉[14];③使用低熔點瓊脂糖固定[15]。有些試驗研究并未提及使用的具體固定方法。該研究采用4種不同的固定方法，比較其在斑馬魚活

體成像研究中的固定效果，結果發(fā)現(xiàn)使用6%甲基纖維素/

0.05%MS-222固定方法較其他3種固定方法更為有效，使

用固定液無須現(xiàn)配現(xiàn)

用，固定仔魚所需時間短，操作過程中魚體位不易變化，且仔

魚不容易震動。這種固定方法可操作性更強，更適用于活體斑馬魚成像觀察，為活體斑馬魚成像觀察研究建立了一種新方法。

參考文獻

[1] VARGAS R A，SARMIENTO K，VSQUEZ I C.Zebrafish（Danio rerio）：A potential model for toxinological studies[J].Zebrafish，2015，12（5）：320-326.

[2] HOLTZMAN N G，IOVINE M K，LIANG J O，et al.Learning to fish with genetics：A primer on the vertebrate model Danio rerio[J].Genetics，2016，203（3）：1069-1089.

[3] GRUNWALD D J，EISEN J S.Headwaters of the zebrafish-emergence of a new model vertebrate[J].Nature reviews genetics，2002，3（9）：717-724.

[4] HOWE K，CLARK M D，TORROJA C F，et al.The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome[J].Nature，2013，496（7446）：498-503.

[5] 李雯，何英姿，孫珊，等.斑馬魚側線神經(jīng)丘毛細胞發(fā)育的研究[J].聽力學及言語疾病雜志，2014，22（1）：60-66.

[6] 李闊宇，潘魯湲，孫永華.斑馬魚魚房和養(yǎng)殖系統(tǒng)建設標準[J].中國比較醫(yī)學雜志，2020，30（6）：121-127.

[7] 諶晶晶，唐旭霞，徐慧芳，等.馬兜鈴酸對斑馬魚的耳毒性及腎毒性研究[J].聽力學及言語疾病雜志，2020，28（1）：57-61.

[8] 羋肖肖，嚴健，李圓，等.順鉑誘導斑馬魚側線毛細胞損傷及再生模型的建立[J].中華耳科學雜志，2016，14（5）：670-673.

[9] 甘津凡，吳永梅，李淑蓉，等.不同濃度的二甲基亞砜對斑馬魚胚胎及其多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2019，41（16）：1538-1544.

[10] 鐘健，朱佳瑞，何欣宇，等.斑馬魚模型在納米毒理學中的研究應用與進展[J].中國比較醫(yī)學雜志，2020，30（8）：107-113，118.

[11] VLASITS A L，SIMON J A，RAIBLE D W，et al.Screen of FDA-approved drug library reveals compounds that protect hair cells from aminoglycosides and cisplatin[J].Hearing research，2012，294（1/2）：153-165.

[12] NAMDARAN P，REINHART K E，OWENS K N，et al.Identification of modulators of hair cell regeneration in the zebrafish lateral line[J].Journal of neuroscience，2012，32（10）：3516-3528.

[13] 陳颯，周金章，翁宇航，等.H2O2對斑馬魚側線毛細胞再生的影響[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016，30（23）：1881-1884.

[14] 周婷婷，范純新，鄒莎，等.Eya1-Six1信號在斑馬魚側線神經(jīng)丘毛細胞再生過程中的表達[J].上海海洋大學學報，2013，22（6）：801-806.

[15] ROMERO-CARVAJAL A，ACEDO J N，JIANG L J，et al.Regeneration of sensory hair cells requires localized interactions between the Notch and Wnt pathways[J].Developmental cell，2015，34（3）：267-282.