羅江瓊，陳紫君，李延明，袁林穎，周四明，龐 科，張 瑩,*

1. 重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬永川醫(yī)院，重慶 402160；2. 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，重慶 402160

能量攝入與消耗不平衡會(huì)引起脂肪的增加，最終導(dǎo)致肥胖[1]。在現(xiàn)代社會(huì)中，由于高脂肪、高熱量的飲食和久坐不動(dòng)的生活方式，超重以及肥胖癥患者數(shù)量不斷增加[2-3]，肥胖引起的胰島素抵抗、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病的病發(fā)率逐年升高[4-5]。近年來的研究表明，脂肪組織不僅是提供能量貯備的終末分化器官，也是一種內(nèi)分泌器官[6]。脂肪組織能夠分泌多種具有生物活性的多肽，這些多肽被稱為脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素與抵抗素等[7-10]。脂肪因子通過自分泌和旁分泌途徑調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化、代謝以及局部炎癥反應(yīng)，并且在胰島素耐受性和慢性炎癥過程中起到重要作用[11-12]。

EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）是綠茶的主要有效成分，在抗氧化活性、抗血管生成、抗腫瘤、心血管保護(hù)和血脂調(diào)節(jié)等方面有重要作用[13-17]。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EGCG有抑制脂肪生成的作用。早在2002年，Prusty等[18]發(fā)現(xiàn)EGCG能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞凋亡從而抑制脂肪的生成。同時(shí)有研究證實(shí)，EGCG可通過抑制脂質(zhì)積累以及激活脂肪酸生物合成限速酶和乙酰輔酶a羧化酶來抑制脂肪細(xì)胞的分化[19]。Wolfram等發(fā)現(xiàn)，100 μM的EGCG能夠顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖[20]。Liu等研究證實(shí)，EGCG可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路的細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶（ERKs）抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞分化和抵抗素基因的表達(dá)[21]。

“Forkhead”，即叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子，蛋白質(zhì)超家族的一種。哺乳動(dòng)物的FOXO蛋白屬于叉頭蛋白家族的“O”亞家族[22]，F(xiàn)OXO家族成員包括FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6等[23]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO1作為AKT通路下游信號(hào)之一，在許多動(dòng)物組織中都高度表達(dá)，包括參與細(xì)胞增殖與分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯性、DNA修復(fù)、發(fā)育分化及糖代謝等[24-27]生理作用。研究發(fā)現(xiàn)FOXO1也參與了脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控，F(xiàn)OXO1通過與啟動(dòng)子激活受體γ（PPARγ）結(jié)合從而抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性影響脂肪形成[30]。哺乳動(dòng)物的FOXO1轉(zhuǎn)錄因子有三個(gè)高度保守的磷酸化位點(diǎn)，Thr24、Ser256 與Ser319[31]。FOXO1表達(dá)受到PI3k/AKT信號(hào)通路磷酸化調(diào)控，當(dāng)PI3K/AKT信號(hào)通路被激活時(shí)磷酸化的FOXO1蛋白結(jié)合在14-3-3蛋白位點(diǎn)上被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，其轉(zhuǎn)錄功能受到抑制[32]。Kim等研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過失活FoxO1和SREBP1c抑制脂肪細(xì)胞分化，之后他們又發(fā)現(xiàn)EGCG可通過胰島素信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路導(dǎo)致FOXO1轉(zhuǎn)錄失活從而抑制脂肪細(xì)胞分化。

本試驗(yàn)通過添加不同濃度外源EGCG，研究EGCG對(duì)前體脂肪細(xì)胞分化的影響，并探討其影響的分子作用機(jī)制，以期為EGCG防治肥胖發(fā)生提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞購買于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

EGCG（純度90%），購于海富生物工程有限公司；I型膠原酶、胰蛋白酶，購于Sigma公司；紅細(xì)胞裂解液、油紅O，購于Solarbio；DMEM/F12、PBS（無鈣、鎂），購于Hyclone公司；FOXO1、P-FOXO1、PPARγ、FAS、β-actin抗體，購于Abcam公司；胎牛血清、RNA抽提試劑Trizol、RNase-free-ddH2O、氯仿、無水乙醇、異丙醇等國產(chǎn)分析純，購于天根生化科技有限公司。

主要試劑盒為 SYBR Prime Script TMRTPCR Kit與Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser，購于寶生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

根據(jù)鄭國棟等[34]的試驗(yàn)方法，將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種至6孔板中，用DMEM完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液。當(dāng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)，分別在含有不同濃度（0 μM 、5 μM、 10 μM、5 0 μM、100 μM）EGCG的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo)8 d。提取總RNA和總蛋白進(jìn)行RT-qPCR及Western blot檢測(cè)。

1.3.2 油紅O染色法檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)含量

分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞在含有不同濃度（0 μM、5 μM、10 μM、50 μM、100 μM）EGCG培養(yǎng)8 d后用于油紅O染色，染色方法參照Zhong、Jeong等[35-36]。細(xì)胞用PBS洗3次，10%甲醛固定10 min，接著再用PBS洗3次，并晾干20 min。油紅O染色細(xì)胞，蘇木精復(fù)染，倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 RT-qPCR檢測(cè)

將細(xì)胞樣提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。各基因引物由引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5設(shè)計(jì)。退火溫度（Tm）通過跑梯度PCR獲得，各基因引物的序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers sequences of qPCR

1.3.4 Western blot分析

參照史新娥等[37]的試驗(yàn)方法提取細(xì)胞總蛋白。利用Bradford法測(cè)定其濃度，并進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳。目的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，孵育一抗（1∶2000），4℃過夜。接著孵育二抗（1∶4000），以β-actin作為內(nèi)參。最后用Bio-Rad GS-800曝光目的蛋白，并利用Quantity One分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，SPSS 18.0軟件中的One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，以P< 0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EGCG對(duì)前脂肪細(xì)胞分化的影響

如圖1所示，在 5 μM、10 μM、50 μM、100 μM的EGCG分別誘導(dǎo)8 d后，3T3-L1細(xì)胞出現(xiàn)大量脂滴。隨著EGCG濃度增加，脂滴數(shù)量逐漸減少。其中，100 μM組中的脂質(zhì)含量最低，與5 μM組脂質(zhì)含量差異極顯著（p< 0.01）。結(jié)果表明，EGCG抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，阻礙脂質(zhì)積累，并具有濃度效應(yīng)，EGCG濃度越高抑制作用越明顯。

圖1 不同濃度EGCG對(duì)前脂肪細(xì)胞分化影響Figure 1 Effects of different concentrations of EGCG on 3T3-L1 preadipocyte differentiation

2.2 不同濃度EGCG對(duì)PPARγ與FAS表達(dá)的影響

PPARγ與FAS（脂肪酸合成酶）能夠有效促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化，因此試驗(yàn)進(jìn)一步探討了不同濃度EGCG分別對(duì)PPARγ、FAS的mRNA與蛋白表達(dá)的影響。如圖2所示，隨著EGCG濃度增加，PPARγ與FAS的表達(dá)量顯著下降。其中，在10 μM、50 μM與5 μM 組中，PPARγ和FAS的mRNA與蛋白表達(dá)差異均顯著（p<0.05）；而在 100 μM 組中，PPARγ和 FAS的mRNA與蛋白表達(dá)量極顯著下調(diào)（p< 0.01）。表明EGCG能直接抑制PPARγ和FAS的表達(dá)，從而影響前脂肪細(xì)胞分化。

圖2 不同濃度EGCG在脂肪生成過程中對(duì)PPARγ、FAS表達(dá)的影響Figure 2 Effects of different concentrations of EGCG on the expression of PPARγ, FAS during adipogenesis

2.3 EGCG對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路及FOXO1與P-FOXO1的影響

結(jié)果如圖3所示，磷酸化的P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1蛋白表達(dá)水平隨EGCG濃度的升高而降低，并且在100 μM組中達(dá)到最低，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性。然而，PI3K、AKT以及FOXO1蛋白表達(dá)量不受EGCG誘導(dǎo)的影響。磷酸化的P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1與正常PI3K、AKT以及FOXO1蛋白表達(dá)量比值也隨EGCG水平升高而降低。

圖3 不同濃度EGCG在脂肪生成過程中對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路及FOXO1、P-FOXO1表達(dá)的影響Figure 3 Effects of different concentrations of EGCG on PI3K/AKT signaling pathway and the expression of FOXO1, P-FOXO1 during adipogenesis

3 討論與結(jié)論

成熟脂肪細(xì)胞的一個(gè)重要特征就是積累脂質(zhì)的能力。有研究表明，高糖和高脂肪飲食能夠誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗并引起肥胖[38]。通常，當(dāng)攝入能量超過消耗時(shí)，多余能量以甘油三酯形式儲(chǔ)存在脂肪組織中。成熟的脂肪細(xì)胞體積顯著增大取決于甘油三酯數(shù)量，甘油三酯量越多，細(xì)胞越肥大[39]。因此，本試驗(yàn)通過對(duì)不同濃度EGCG誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色并測(cè)定其甘油三酯的含量，結(jié)果表明，EGCG在脂肪生成過程中阻礙了脂滴的攝取和聚集。有報(bào)道表明，成年人輕度肥胖主要表現(xiàn)為肥大性肥胖，而兒童期肥胖或更嚴(yán)重的肥胖則為增生性肥胖[40]。盡管如此，肥大性和增生性肥胖都是前脂肪細(xì)胞的增殖分化，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境和基因表達(dá)條件下，前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞[41-42]。因此，如果可以通過改變細(xì)胞的分化條件或操縱基因表達(dá)譜來抑制前脂肪細(xì)胞的分化，則有可能對(duì)肥胖進(jìn)行預(yù)防和治療。本試驗(yàn)結(jié)果表明，外源添加不同濃度EGCG可不同程度抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，因此我們推測(cè)EGCG具有抑制前脂肪細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的功能。

大量研究表明，PPARγ能夠促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化和成熟，它與FAS在脂肪酸合成和脂肪生成過程中起決定性作用[43-45]。Kumar等[46]研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜提取物通過上調(diào)PI3K和PPARγ能夠提高由GLUT-4介導(dǎo)的糖攝取。Li[47]等人證實(shí)促進(jìn)PPARγ表達(dá)能夠上調(diào)GLUT-4以及脂聯(lián)素表達(dá)，同時(shí)加快3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，外源添加特定濃度的EGCG導(dǎo)致PPARγ和FAS的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了EGCG具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的功能。

大量研究表明，PI3K-AKT級(jí)聯(lián)信號(hào)通路參與了早期脂肪的形成。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)PI3KAKT信號(hào)通路在預(yù)防肥胖和糖尿病方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，主要負(fù)責(zé)改善胰島素敏感性[35]。Harmon等發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/AKT信號(hào)通路可有效抑制前脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取[49]。此外，Kim等發(fā)現(xiàn)柑橘類黃酮化合物可以通過抑制AKT信號(hào)通路從而阻礙3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化[50]。因此，我們推測(cè)EGCG抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化可能通過PI3K/AKT級(jí)聯(lián)信號(hào)通路來發(fā)揮作用。FOXO1作為PI3K/AKT通路的下游信號(hào)在PI3K和PPARγ之間發(fā)揮其功能[48]；FOXO1能夠與PPARγ的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制PPARγ的核轉(zhuǎn)錄。當(dāng)FOXO1上游的激酶AKT調(diào)控FOXO1發(fā)生磷酸化作用，磷酸化的FOXO1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，其抑制PPARγ和FAS表達(dá)的功能喪失[30]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG濃度增加，P-PI3K、P-AKT以及P-FOXO1蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，表明不同濃度的EGCG能夠不同程度的抑制FOXO1磷酸化，從而阻礙3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化。

綜上，EGCG可通過介導(dǎo)PI3K/AKTFOXO1級(jí)聯(lián)信號(hào)通路下調(diào)PPARγ和FAS表達(dá)，從而抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化，阻礙脂肪生成。本研究結(jié)果可為EGCG及其類似預(yù)防和治療肥胖相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。