蘭 余，呂楊俊，張海華，朱躍進(jìn)，劉 均，曹曉念，馮華芳，劉青青，張 平，張士康*

1. 瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；2. 中華全國(guó)供銷合作總社 杭州茶葉研究院，浙江 杭州 310016

茶多酚占茶葉干重的15% ～ 30%，而兒茶素占茶多酚總量的60% ～ 80%。茶鮮葉中兒茶素主要以表型結(jié)構(gòu)存在，主要有EGCG（表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯）、EGC（表沒(méi)食子兒茶素）、ECG（表兒茶素沒(méi)食子酸酯）和EC（表兒茶素）四種[1-3]。兒茶素溶于水、乙醇、冰醋酸、丙酮溶劑，其分子結(jié)構(gòu)中的B 環(huán)酚羥基活躍，使得兒茶素在溶劑中易發(fā)生異構(gòu)化、水解、氧化/聚合、縮合等轉(zhuǎn)化反應(yīng)[4-5]。兒茶素在溶劑體系中的變化情況，關(guān)系其在食品、醫(yī)藥等多領(lǐng)域的應(yīng)用性能，因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)兒茶素在食品飲料、焙烤加工、熱水提制、茶湯沖泡乃至血液等方面的變化開展了多樣研究[6-10]。這些研究都是以水為溶劑，不含乙醇。但隨著兒茶素功能應(yīng)用范圍的拓寬和廣泛關(guān)注，兒茶素在含乙醇體系中的變化研究必不可缺。本文針對(duì)兒茶素在乙醇體系（含硬飲料）中變化研究的盲點(diǎn)，開展兒茶素在蒸餾酒和水兩種體系中的變化對(duì)比性研究，以期彌補(bǔ)研究空白，亦期為兒茶素在食品硬飲料中應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

茶多酚和兒茶素單體（中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院食品技術(shù)研究所），經(jīng)水法粗提、專用樹脂純化、中壓色譜分離制得。其中，茶多酚，含總多酚81.98%、EGCG 33.45%、EC 2.80%、ECG 7.73%、EG 3.55%、GA 0.18%、CAF 0.88%；EGCG，純度77.89%；EGC，純度77.75%；ECG，純度84.32%；EC，純度86.29%。蒸餾酒（瀘州老窖股份有限公司，酒精度45.5%，生產(chǎn)批號(hào)2015-04-14），四川瀘州老窖生產(chǎn)基地經(jīng)固態(tài)純糧發(fā)酵制得。冰乙酸、乙腈、甲醇等化學(xué)試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），均為色譜純。

1.1.2 主要儀器

Waters 1525系列高效液相色譜儀及Waters 2998紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器成套設(shè)備（上海Waters科技有限公司），C18色譜柱4.6*250 mm，5 μm（美國(guó)菲羅門Phenomenex公司），分析天平（1/10000）（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取綠茶茶多酚與4種兒茶素單體各1.00 g，分別于蒸餾酒和水體系中溶解并定容至1000 mL，四等份分裝于250 mLPET瓶中密封、25℃避光貯藏，于第0 d、1 d、2 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d、105 d、120 d取樣測(cè)定兒茶素含量。

1.2.2 兒茶素總量及組分測(cè)定

按GB/T 8313—2018方法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品重復(fù)制備3 次，樣品中兒茶素含量重復(fù)測(cè)定 3 次。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

采用EXCEL計(jì)算平均值。兒茶素測(cè)定數(shù)據(jù)的圖表制作、線性擬合采用EXCEL軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素在蒸餾酒和水體系中貯藏變化

圖1 可見，茶多酚（TP）和四種兒茶素單體（EGCG、EGC、ECG、EC）在25℃避光條件下于蒸餾酒和水兩種體系中變化存在差異。圖1（Ⅰa）顯示，茶多酚在蒸餾酒體系中隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，四種主要兒茶素總量逐漸降低，其中簡(jiǎn)單兒茶素（EC、EGC）降幅最大，EGC在30 d時(shí)降至檢出限（0.01 μg/mL）下，EC在60 d時(shí)已降了2/3至15 μg/mL。酯型兒茶素（EGCG、ECG）亦呈下降趨勢(shì)，降幅較簡(jiǎn)單兒茶素小，至120 d時(shí)約降低50%。圖1（Ⅰb）顯示，茶多酚在水體系中隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酯型兒茶素（EGCG、ECG）均呈下降趨勢(shì)，其中EGCG尤為明顯；簡(jiǎn)單兒茶素（EGC、EC）呈增大結(jié)果，尤其是EGC；此外，在水體系中6 ～ 90 d期間還測(cè)定出GA（沒(méi)食子酸）。

圖1 四種兒茶素在蒸餾酒（a）和水（b）中濃度變化（Ⅰ:茶多酚；Ⅱ:EGCG；Ⅲ:EGC；Ⅳ:ECG；Ⅴ:EC）Figure 1 Concentration changes of four catechins in distilled wine (a) and water (b)system

圖1（Ⅱa）可看出，EGCG單體在蒸餾酒中變化趨勢(shì)與茶多酚中EGCG具有一致性，隨時(shí)間出現(xiàn)降低，同時(shí)體系中可測(cè)得ECG隨時(shí)間呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。馬夢(mèng)君等[11]研究發(fā)現(xiàn)，25℃下貯藏的茶多酚水溶液中兒茶素總量及EGCG、ECG含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低。圖1（Ⅱb）可看出，EGCG單體在水中隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，同時(shí)EGC和GA出現(xiàn)增加趨勢(shì)，體系貯藏中兒茶素單體測(cè)定值總和80%分布在720 μg/mL以上，與初始值770 μg/mL相差約50 μg/mL。

圖1（Ⅲa）結(jié)果顯示，EGC在蒸餾酒中降低趨勢(shì)明顯，在0 ～ 30 d時(shí)可測(cè)到樣品中初始含有的微量ECG、EGCG至30 d后均低于檢出限，同時(shí)EGC降低趨勢(shì)未變。圖3（Ⅲb）結(jié)果顯示，EGC在水體系中也呈降低趨勢(shì)，降幅較蒸餾酒體系中小，同時(shí)伴隨微量EGCG和ECG可檢出。

圖1（Ⅳa）可看出，ECG單體在蒸餾酒中降幅明顯，且未曾檢測(cè)出其他三種單體。圖1（Ⅳb）可看出，ECG單體在水體系中表現(xiàn)出和EGCG單體相似變化，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，ECG降低的同時(shí)EC和GA增多且單體體系中兒茶素總量保持較高濃度。

圖1（Ⅴa）顯示，EC單體在蒸餾酒中降幅明顯，幾乎未檢測(cè)到其他三種單體。圖1（Ⅴb）顯示，EC單體在水中總體下降，120 d時(shí)達(dá)最低濃度720 μg/mL，未檢出其他三種單體和GA。

2.2 兒茶素在蒸餾酒和水中的穩(wěn)定性比較

對(duì)蒸餾酒體系而言，對(duì)比圖1（Ⅰa ～Ⅴa），四種兒茶素?zé)o論是混合態(tài)還是單體在蒸餾酒體系中均呈一致降低的趨勢(shì)，從結(jié)果推測(cè)降低過(guò)程中幾乎不能有兒茶素單體之間的轉(zhuǎn)化。經(jīng)數(shù)學(xué)擬合處理，四種單體在蒸餾酒體系中變化都較符合一元線性關(guān)系（R2= 0.8591 ～ 0.9661），按四種單體濃度降低50%的時(shí)間長(zhǎng)短排序?yàn)镋GCG＜EGC＜EC＜ECG（表1），此時(shí)間順序表征了四種單體在蒸餾酒中的穩(wěn)定性。同步擬合茶多酚（混合態(tài)）中EGCG的變化，同樣呈線性關(guān)系，濃度降低50%，時(shí)間卻延長(zhǎng)至45 d。

表1 兒茶素在蒸餾酒體系中變化線性擬合結(jié)果Table 1 Linear fitting results of catechins in distilled liquor system

對(duì)水體系而言，對(duì)比圖1（Ⅰb ～ Ⅴb），四種兒茶素?zé)o論單體還是混合態(tài)都呈趨勢(shì)一致的變化，四種兒茶素單體總量略有降低，但基本維持在A 0 ～ 70%A 0范圍（A0，0 d測(cè)定值），總體上簡(jiǎn)單兒茶素比酯型兒茶素穩(wěn)定。從測(cè)定值推測(cè)，兩種酯型兒茶素（EGCG、ECG）均發(fā)生了較大程度的水解反應(yīng)，即EGCG→EGC+GA，ECG→EC+GA；兩種簡(jiǎn)單兒茶素（EGC、EC）發(fā)生了30%左右的小幅降低，幾乎不能推測(cè)出單體間轉(zhuǎn)化反應(yīng)的發(fā)生。

對(duì)比兩種體系，從四種單體的分子結(jié)構(gòu)（圖2）這一根本闡釋，四種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)主要差異在于R1和R2基團(tuán)，結(jié)合蒸餾酒體系中四種單體的Date[C50]（d）結(jié)果，加之乙醇分子中的羥基可形成氫鍵，且乙醇4.3＜蒸餾酒的溶解度參數(shù)（極性）7.52＜水10.20，推測(cè)四種兒茶素分子結(jié)構(gòu)中R2基團(tuán)比R1基團(tuán)更活躍，即R2基團(tuán)比R1基團(tuán)對(duì)兒茶素在蒸餾酒中不穩(wěn)定的貢獻(xiàn)度更高、作用更強(qiáng)。

圖2 （-）-表型（順式）兒茶素類分子結(jié)構(gòu)圖Figure 2 Molecular structure of (-)-phenotypic (CIS) catechins

3 討論

本試驗(yàn)探討了25℃避光密封貯藏下四種兒茶素在蒸餾酒和水兩種體系中含量的變化，結(jié)果表明茶多酚和四種兒茶素單體在蒸餾酒和水兩種體系中穩(wěn)定性表現(xiàn)差異較大，在水中的穩(wěn)定性比蒸餾酒體系中高。從兒茶素類變化的可能性反應(yīng)原理推測(cè)，在蒸餾酒體系中尤為顯著的發(fā)生了非水解反應(yīng)，極可能是發(fā)生了氧化、聚合等其他類型的反應(yīng)；而在水體系中酯型兒茶素和簡(jiǎn)單兒茶素的下降趨勢(shì)一致，但下降原因各異，其中酯型兒茶素主要發(fā)生了水解反應(yīng)含量降低，而簡(jiǎn)單兒茶素則發(fā)生了水解以外的其他反應(yīng)。從蒸餾酒和水兩種體系本身而言，蒸餾酒中除含有乙醇外，還含有重要呈香類物質(zhì)如酯類、其他醇類等多羥基化合物，從理論上推測(cè)這些化合物的羥基對(duì)兒茶素類變化極可能產(chǎn)生影響，這也可能是兒茶素類在蒸餾酒和水體系中變化不一致的重要因素。試驗(yàn)結(jié)果為兒茶素類在食品體系中的穩(wěn)定性研究提供了新的數(shù)據(jù)。