孔祥一, 莊麗麗, 方恩華, 林 鵬, 鄭子龍, 鄭向華, 徐敦明*

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 福建 廈門 361021; 2. 廈門海關(guān)技術(shù)中心, 福建 廈門 361000; 3. 福建省市場監(jiān)督管理局, 福建 福州 350003)

亞硝胺是一類含有N-亞硝基(N-NO)的亞硝基化合物[1],廣泛存在于飲用水、熏肉制品和腌制蔬菜中[2]。蛋白質(zhì)腐敗分解時可以產(chǎn)生胺類物質(zhì),因此蛋白質(zhì)含量豐富的食物往往容易N-亞硝胺類化合物含量超標(biāo),此外經(jīng)過煙熏、油炸、腌制的動物源性食品也容易產(chǎn)生亞硝胺[3]。1937年,Freund[4]第一次報道了兩例由于職業(yè)接觸N-亞硝基二甲胺(NDMA)而導(dǎo)致中毒的案例,目前已經(jīng)證實亞硝胺對生物具有很強的基因毒性,可誘導(dǎo)人體的食管、肝臟和腎臟等器官發(fā)生癌癥[5],其中NDMA、N-二乙基亞硝胺(NDEA)被國際癌癥研究機構(gòu)(IRAC)評定為2A級致癌物,其他的N-亞硝胺類化合物為2B級致癌物。目前,我國在GB 2762-2017食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中也對動物源性食品中NDMA限量指標(biāo)做了要求,其中肉及肉制品(肉類罐頭除外)的限量為3 μg/kg,水產(chǎn)動物及其制品(水產(chǎn)品罐頭除外)的限量為4 μg/kg。動物源性食品中的N-亞硝胺類化合物嚴(yán)重危害人體健康,如何控制動物源性食品生產(chǎn)過程中N-亞硝胺類化合物的產(chǎn)生也是當(dāng)前N-亞硝胺類化合物研究的重要方向,開發(fā)對N-亞硝胺類化合物含量進(jìn)行快速檢測和定量的技術(shù)尤為重要[6]。

熱能分析儀作為基于化學(xué)發(fā)光設(shè)計的專門測定N-亞硝胺類化合物的檢測器,具有檢測快速、靈敏度高的優(yōu)點[7,8],但其價格昂貴,應(yīng)用范圍窄,且使用過程中經(jīng)常需要檢修和維護(hù),一般實驗室都未配備,故基于熱能分析儀的N-亞硝胺類化合物檢測法未能廣泛應(yīng)用。此外，針對亞硝胺的檢測方法還有色譜-核磁法[9]、電化學(xué)檢測法[10-13]、液相色譜法[14]、液相色譜-質(zhì)譜法[15,16]、氣相色譜-氮磷檢測器法[17]、氣相色譜-質(zhì)譜法[18-20]等。其中電化學(xué)檢測方法的精度和靈敏度仍有待提高;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對相對分子質(zhì)量較小的N-亞硝胺類化合物的響應(yīng)無法達(dá)到要求;氣相色譜-質(zhì)譜法容易產(chǎn)生NDMA假陽性現(xiàn)象,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其高特異性和高靈敏度,是目前針對N-亞硝胺類化合物檢測最為廣泛使用的方法。

N-亞硝胺類化合物的前處理方法主要包括液液萃取法、水蒸氣蒸餾萃取法、超臨界萃取法和QuEChERS等。目前國內(nèi)對N-亞硝胺類化合物的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為GB 5009.26-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N-亞硝胺類化合物的測定》,其提取方法為水蒸氣蒸餾法,但該方法的樣品需求量過大,操作過程復(fù)雜,耗時較長,且回收率波動較大;朱萌萌等[21]采用蒸餾萃取法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對肉制品中10種揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物進(jìn)行檢測,可實現(xiàn)蒸餾和提取同時進(jìn)行,但仍存在耗時較長和樣品用量大等問題,在面對大量待測樣品時具有一定的局限性;何淑娟等[22]和高蕙文等[23]利用凈化劑對N-亞硝胺類化合物提取液進(jìn)行凈化后氮吹至近干,但N-亞硝胺類化合物在氮吹至近干時損失較大,容易造成回收率較低;李瑋等[24]使用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基鍵合硅膠(C18)和無水硫酸鈉對N-亞硝胺類化合物提取液進(jìn)行凈化和除水,但PSA的凈化效果較弱,可能導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確;硫酸鈉除水效果較弱,可能造成除水不徹底,從而影響儀器性能。

QuEChERS是近年來國際上興起的一種新型農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理技術(shù),是利用基質(zhì)分散萃取機理來吸附樣品中的雜質(zhì),從而達(dá)到保留目標(biāo)物和凈化樣品的目的。本文通過優(yōu)化樣品前處理條件、色譜和質(zhì)譜條件,建立了QuEChERS-同位素稀釋-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時快速測定動物源性食品中9種N-亞硝胺類化合物的方法。該方法具有操作簡單、提取高效、更加經(jīng)濟的優(yōu)點,可準(zhǔn)確、快速測定動物源性食品中的N-亞硝胺類化合物。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7890氣相色譜-7000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Agilent公司); 2-16KL高速離心機(德國Sigma公司); VORTEX 3渦旋混勻儀(德國IKA公司)。

乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯均為色譜純(德國Merck公司); MgSO4和NaCl均為分析純(廣州西隴化工有限公司),聚苯乙烯二乙烯苯聚合物(PLS-A)、十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)(北京迪馬公司);增強型脂質(zhì)去除(EMR)小柱(美國Agilent公司);實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。

9種N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)品包括NDMA、N-亞硝基乙基甲基胺(NMEA)、NDEA、N-亞硝基二丁胺(NDBA)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)、N-亞硝基哌啶(NPIP)、N-亞硝基嗎啉(NMorPh)、N-亞硝基二苯胺(NDPhA)及內(nèi)標(biāo)N-亞硝基二甲胺-d6(NDMA-d6)、N-亞硝基二正丙胺-d14(NDPA-d14),均購自英國LGC公司,質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將9種N-亞硝胺類化合物標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/mL)用乙腈稀釋配制成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,低于-18 ℃避光保存,有效期6個月。

將內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 μg/mL)用乙腈稀釋配制成1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液,低于-18 ℃避光保存,有效期6個月。

1.2.2樣品前處理

液態(tài)樣品搖勻后提取處理;粉狀樣品直接提取處理；其他樣品取可食部分組織搗碎。將制備好的試樣于0～5 ℃冷藏保存,待測。

提取:稱取10 g(精確至0.01 g)試樣,置于50 mL離心管中,加入200 μL內(nèi)標(biāo)工作液和10 mL乙腈,渦旋1 min混勻,置于冰箱-20 ℃冷凍30 min,加入陶瓷均質(zhì)子2粒、4 g MgSO4和1 g NaCl,渦旋1 min,于0 ℃以9 000 r/min離心5 min,上清液待凈化。

凈化:取150 mg PLS-A粉末和5 mL水，置于15 mL離心管中,振蕩后加入5 mL上述上清液,并渦旋1 min,于0 ℃以9 000 r/min離心5 min。

除水:將凈化液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中,加入1.6 g MgSO4和0.4 g NaCl,渦旋30 s,于0 ℃以9 000 r/min離心5 min,取1 mL上層有機相過0.22 μm微孔濾膜,然后移入進(jìn)樣瓶中上機檢測。

1.2.3分析條件

色譜柱:毛細(xì)管氣相色譜柱HP-Innowax(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);進(jìn)樣口溫度:220 ℃;載氣:氦氣;流速60 mL/min;溶劑放空模式;程序升溫模式:初始溫度50 ℃,保持0.16 min,以900 ℃/min升溫至220 ℃,保持5 min;進(jìn)樣量5 μL。

電子轟擊電離(EI)源;離子源溫度250 ℃;傳輸線溫度250 ℃;溶劑延遲6 min;電子能量:70 eV;采集模式:MRM模式。9種亞硝胺類化合物及內(nèi)標(biāo)的保留時間、前體離子、子離子、碰撞能量(CE)見表1。

表 1 9種N-亞硝胺類化合物及2種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 不同提取溶劑對9種N-亞硝胺類化合物回收率的影響Fig. 1 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the nine N-nitrosamines

2 結(jié)果與討論

2.1 提取液的選擇

N-亞硝胺類化合物相對分子質(zhì)量較小,極性較強,在強極性溶劑中溶解性更強,常用的提取溶劑有乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯[25]。實驗對這3種溶劑進(jìn)行對比,結(jié)果見圖1?？梢钥闯?乙腈對N-亞硝胺類化合物的溶解性較強,對油脂和色素等雜質(zhì)溶解度相對較小,提取效率最佳;乙酸乙酯對極性強的N-亞硝胺類化合物提取效果較差,且容易與油脂共萃取,從而對上機造成干擾;二氯甲烷提取效果差,且操作中由于揮發(fā)性極強容易造成誤差。因此本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 吸附劑的選擇

肉制品、水產(chǎn)品等動物源性食品通常含有色素、脂肪酸等復(fù)雜基質(zhì),很容易影響測定的準(zhǔn)確性。C18通常用來去除脂肪酸、色素，同時吸附非極性化合物,PLS-A可較好地吸附有機酸、脂肪酸、糖、色素等干擾物質(zhì)。根據(jù)何淑娟等[22]的研究,本文選取PLS-A粉末、C18粉末和EMR小柱對其凈化效果進(jìn)行對比。準(zhǔn)備待測樣品3份,將樣品中加入200 μLN-亞硝胺類化合物內(nèi)標(biāo)工作液,其中兩份樣品分別用150 mg PLS-A和150 mg C18進(jìn)行凈化處理,第三份樣品采用EMR小柱凈化,3份樣品按照1.2.2節(jié)進(jìn)行處理,其中EMR小柱加入1 mL水進(jìn)行活化后再加入1.2.2節(jié)的待凈化液4 mL進(jìn)行凈化,樣品回收率見圖2。結(jié)果表明,采用PLS-A時,凈化效果較好,對油脂、色素等雜質(zhì)的凈化效果理想。因此本文采用PLS-A作為凈化劑。

圖 2 不同凈化方式對9種N-亞硝胺類化合物回收率的影響Fig. 2 Effect of different purification methods on the recoveries of the nine N-nitrosamines PLS-A: polystyrene divinylbenzene polymer; EMR: enhanced lipid removal.

經(jīng)由PLS-A凈化后的溶液含水,需除水后才能進(jìn)行儀器分析,本方法采用MgSO4和NaCl作為除水劑。NaCl可以增強溶液極性,減小N-亞硝胺類化合物在水中的溶解度,得到更高的萃取效率;MgSO4除水能力更好,但在吸水過程中會大量放熱,亞硝胺在高溫條件下易揮發(fā),減少MgSO4的用量可減少損失,但減少過多又容易導(dǎo)致除水不徹底。經(jīng)對比研究最終采用1.6 g MgSO4和0.4 g NaCl除水。

2.3 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

參考翟孟婷等[26]的研究結(jié)果,選用毛細(xì)管氣相色譜柱HP-Innowax (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。按1.2.3節(jié)條件對9種N-亞硝胺類化合物進(jìn)行測定,得到總離子流色譜圖和MRM色譜圖(見圖3)。

圖 3 9種N-亞硝胺類化合物及其內(nèi)標(biāo)的總離子流 和MRM色譜圖(10 μg/L)Fig. 3 Total ion current and MRM chromatograms of the nine N-nitrosamines and their IS (10 μg/L)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指在測定過程中,由于待測成分的離子化效應(yīng)被改變,從而信號受到增強或者抑制的現(xiàn)象?；|(zhì)效應(yīng)會影響結(jié)果的準(zhǔn)確度。本文參考Al-Kaseem等[14]的方法,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法(基質(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配溶液斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液斜率的比值×100%)來考察N-亞硝胺類化合物在動物源性食品中的基質(zhì)效應(yīng)。ME值在85%～115%之間可認(rèn)為該基質(zhì)不存在基質(zhì)效應(yīng)。用空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液,使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的離子化效應(yīng)相同。結(jié)果表明,9種N-亞硝胺類化合物的ME值均小于70%,可認(rèn)為亞硝胺在動物源性食品中表現(xiàn)出較強的基質(zhì)抑制效應(yīng),為確保測定的準(zhǔn)確性,本文采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

表 3 9種N-亞硝胺類化合物在動物源性食品中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

精密吸取9種N-亞硝胺類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作溶液適量,用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、20.0和50.0 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為20.0 ng/mL,實驗按濃度由低到高的順序進(jìn)樣分析。以N-亞硝胺類化合物及其對應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)的濃度比值為橫坐標(biāo),以N-亞硝胺類化合物及其對應(yīng)氘代同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,從而獲得線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2),見表2。結(jié)果表明,線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.99,說明N-亞硝胺類化合物在0.1～50.0 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。以定量離子信噪比(S/N)為3和10時的響應(yīng)定義方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 9種N-亞硝胺類化合物的檢出限和定量限分別為0.03～0.30 μg/kg和0.10～1.00 μg/kg。

表 2 9種N-亞硝胺類化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

按照前述方法,對不含N-亞硝胺類化合物的魚肉、蝦肉、牛肉和臘腸等4種空白樣品進(jìn)行添加回收試驗,設(shè)定添加水平為0.5、1.0、3.0 μg/kg,考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,9種N-亞硝胺類化合物的回收率為80.4%～98.5%, RSD為2.41%～12.50%,方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表 3 (續(xù))

2.7 實際樣品檢測

按照本文建立的方法對采集的60批動物源性食品,包括肉糜、腌制肉制品、水產(chǎn)制品等樣品進(jìn)行分析,有18批樣品中檢出N-亞硝胺類化合物(見表4),其中NDMA、NDBA、NPIP、NPYR、NDPhA的檢出率最高,且部分腌制水產(chǎn)品的NDMA含量高出我國GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中的限量值(NDMA≤3 μg/kg),其中腌制魷魚絲樣品中的NDMA含量甚至高達(dá)7.93 μg/kg。

表 4 實際樣品中9種N-亞硝胺類化合物的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

建立了QuEChERS-同位素稀釋-GC-MS/MS測定動物源性食品中9種N-亞硝胺類化合物殘留的方法。方法的回收率和精密度良好,線性范圍廣,重復(fù)性好,檢出限低,可以同時對9種N-亞硝胺類化合物快速地進(jìn)行定性和定量分析,從而為動物源性食品中N-亞硝胺類化合物含量的安全評價提供依據(jù)。