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        紅曲磷蝦油軟膠囊的毒理安全性評價

        2021-12-18 02:28:08張金秋張馨欣侯萬萍
        農(nóng)技服務(wù) 2021年10期
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量

        張金秋, 江 賀, 張馨欣, 侯萬萍, 鄒 慧

        (長春康彼達(dá)科技有限公司, 吉林 長春 130012)

        隨著物質(zhì)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,人們攝入高熱量、高油脂食物的量增加,長期攝入高脂食物會干擾體內(nèi)脂質(zhì)代謝和抗氧化能力。當(dāng)體內(nèi)血脂過高后,致使體內(nèi)形成大量自由基,導(dǎo)致細(xì)胞受損,加速細(xì)胞凋亡,人體衰老。脂肪在內(nèi)臟中過多,會導(dǎo)致內(nèi)臟功能減少;在血管內(nèi)沉積,形成動脈粥樣硬化,易引發(fā)心腦血管等疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn),心腦血管疾病患者血液動力學(xué)檢查中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-D)均有所升高,表明心腦血管疾病與血脂異常存在一定的關(guān)系。全球心腦血管的發(fā)病率逐年上升,已嚴(yán)重威脅到人的健康,據(jù)不全統(tǒng)計,每年因心腦血管等疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)20%以上[1]。因此,有效控制血脂是預(yù)防動脈粥樣硬化的有效手段之一。

        紅曲為藥食兩用傳統(tǒng)中藥材,主要含洛伐他汀(Monacolin K)、麥角固醇、γ-氨基丁酸、天然植物激素[2]等,具有調(diào)節(jié)脂代謝、降低血壓、降低血糖、預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松等廣泛的藥理作用[3-5]。南極磷蝦油作為海洋新興油脂,其含有多種不飽和脂肪酸等活性成分,其中具有代表性的EPA、DHA以磷脂形式存在,活性優(yōu)于甘油三酯或乙酯,具有調(diào)節(jié)血脂作用[6-8]。玉米油中含豐富的不飽和脂肪酸、甾醇等成分,其中,亞油酸占油脂總量的50%以上,研究證明玉米油有顯著降低血清膽固醇的作用[9]?!凹t曲磷蝦油軟膠囊”是由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司研制,具有輔助降血脂功能的保健食品,以紅曲粉、南極磷蝦油為原料,玉米油等為輔料制成的軟膠囊。為評價紅曲磷蝦油軟膠囊的安全性,依據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15193.3—2014),采用急性毒性試驗、遺傳毒性試驗、28 d喂養(yǎng)試驗進(jìn)行安全性考察?,F(xiàn)將試驗結(jié)果報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 紅曲磷蝦油軟膠囊 其是以紅曲粉、南極磷蝦油為原料,玉米油為輔料,添加一定的蜂蠟作為助懸劑制成。該膠囊由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司研制(批號:20180701),規(guī)格0.5 g/粒,人體推薦用量為2 粒/次、2次/d。供試品為紅曲磷蝦油軟膠囊的內(nèi)容物。

        1.1.2 儀器與設(shè)備 電子天平(ME204E、AB135-S型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;水浴鍋(HH-S114型),金壇市華龍實驗儀器廠;血細(xì)胞分析儀(BC-280 vet型)、全自動生化分析儀(BS-420型),深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;尿液分析儀(Uritest-200 B),桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司;恒溫培養(yǎng)箱(SPX-100B-Z),上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;超凈工作臺(SJ-CJ-1FD),蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司。

        1.1.3 試驗動物 SPF級SD大鼠、昆明小鼠,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗室提供。

        1.1.4 藥物、試劑等 環(huán)磷酰胺、敵克松、秋水仙堿、疊氮化鈉(NaN3)、2-氨基芴(2-AF)、1,8-二羥基蒽醌、大鼠肝微粒體酶(S9)、小牛血清、Giemsa染液、伊紅染液、磷酸鹽緩沖溶液、尿液分析試紙、生化試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)、TA1535、TA97a、TA98、TA100、TA102菌株,均購自于上海北思生物科技有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 大鼠急性毒性試驗 選取SD大鼠20只,雌雄各半,灌胃前禁食16 h,不限飲水,稱取供試品100 g,按18.43 mL/kg體重(相當(dāng)于人體推薦用量的460倍)分2次(間隔6 h)經(jīng)口灌胃,灌胃后連續(xù)14 d觀察記錄SD大鼠的中毒癥狀及死亡情況。同時選取20只SD大鼠,雌雄各半,做空白對照試驗。試驗0 d、7 d和14 d稱量大鼠體重,試驗結(jié)束后處死解剖[10]。

        1.2.2 遺傳毒性試驗

        1) 細(xì)菌回復(fù)突變試驗。選擇經(jīng)基因型鑒定符合試驗要求的5株組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌(TA1535、TA100、TA97a、TA98、TA102)進(jìn)行試驗。稱取1.0 g供試品,加DMSO至20 mL,混合均勻,第1次5個受試物濃度分別為50 μg/皿、158 μg/皿、500 μg/皿、1 581 μg/皿和5 000 μg/皿,第2次分別為8 μg/皿、4 0 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿和5 000 μg/皿,另設(shè)陽性對照組、自發(fā)回變組和去DMSO對照組,TA1535、TA100:NaN3(1.5 μg,-S9);TA97a、TA98、TA102:敵克松(50.0 μg,-S9),TA102:1,8-二羥基蒽醌(50.0 μg,+S9);TA1535、TA97a、TA98、TA100:2-AF(10.0 μg,+S9)。各組受試物在0.103 MPa下濕熱滅菌20 min。各組均設(shè)3個平行皿,加入0.1 mL菌株增菌液,0.1 mL受試物(或?qū)φ瘴?和0.5 mL S9混合液(試驗組分別設(shè)加與不加S9組),加入保溫的頂層培養(yǎng)基中混合均勻后用平鋪法置于底層培養(yǎng)基平板上,37℃恒溫培養(yǎng)48 h后,統(tǒng)計菌落數(shù),試驗2次重復(fù)。

        2) 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗。取小鼠50只,平均分成5組(每組雌雄各半),分別設(shè)供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組,另設(shè)陰性對照組(大豆油)及陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)。采用30 h灌胃法,第2次(與第1次間隔24 h)灌胃后6 h頸椎脫臼處死,取小鼠胸骨擠出骨髓,混合小牛血清,制片,干燥后固定、Giemsa染色,在顯微鏡下每只小鼠觀察1 000個嗜多染紅細(xì)胞(PCE),計算微核發(fā)生率。

        3) 小鼠精原細(xì)胞畸變試驗。取30只雄性小鼠,平均分成6組,分別設(shè)供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組,另設(shè)溶劑對照組(去離子水)和陽性對照組(環(huán)磷酰胺40 mg/kg)。連續(xù)灌胃5 d,高劑量組分別于末次給藥后24 h和48 h處死,其余劑量組在末次給藥后24 h處死,處死前5 h按5 mg/kg劑量給小鼠腹腔注射秋水仙素溶液(注射體積20 mL/kg BW),將所有小鼠頸椎脫臼處死,取雙側(cè)附睪尾剪碎,加生理鹽水游離出精子,涂片,用1%伊紅染色制片,用光學(xué)顯微鏡觀察完整精子,每只小鼠觀察100個精子,記錄各類畸形精子數(shù),計算畸變發(fā)生率。

        1.2.3 28 d喂養(yǎng)試驗 選用68~93 g離乳SD大鼠100只,平均分成5組(每組雌雄各半),分別設(shè)供試品0.93 g/kg、1.85 g/kg、3.69 g/kg劑量組,另設(shè)陰性對照組(大豆油)。停藥后15 d設(shè)高劑量組恢復(fù)期組和陰性組,每組10只,按4.0 mL/kg每天經(jīng)口灌胃1次,連續(xù)28 d,觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)、中毒癥狀及死亡情況。灌胃結(jié)束后禁食隔夜,逐只稱重,用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈取血測定血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)。

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        對小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行u檢驗;小鼠精原細(xì)胞畸變試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二項分布統(tǒng)計;28 d喂養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 紅曲磷蝦油軟膠囊的急性毒性

        從表1看出,用紅曲磷蝦油軟膠囊18.43 g/kg灌胃后大鼠生長良好,未見體重變化,未見有明顯中毒癥狀,14 d觀察期內(nèi)無死亡。心、肝、脾、肺、腎、腸、胃等主要臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。表明,紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠LD50均大于18.43 g/kg,按劑量分級標(biāo)準(zhǔn),紅曲磷蝦油軟膠囊屬于無毒級別。

        表1 紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠的急性毒性

        2.2 紅曲磷蝦油軟膠囊的遺傳毒性

        2.2.1 細(xì)菌回復(fù)突變試驗 從表2、表3看出,回變菌落數(shù)紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與未處理對照組(自發(fā)回變組)相近,且未發(fā)現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系,試驗結(jié)果為陰性,說明紅曲磷蝦油軟膠囊在+S9和―S9情況下,對5種類型菌株均無致突變性。

        表2 第1次試驗的回變菌落數(shù)

        表3 第2次試驗的回變菌落數(shù)

        2.2.2 小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗 從表4看出,紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組的PCE/NCE與陰性對照組差異均不顯著(P>0.05),表明紅曲磷蝦油軟膠囊對骨髓紅細(xì)胞增殖無明顯抑制;雌、雄小鼠陽性對照組的微核率與陰性對照組間差異極顯著,表明紅曲磷蝦油軟膠囊小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗結(jié)果均為陰性。

        表4 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核率(n=5)

        2.2.3 小鼠精原細(xì)胞畸變試驗 染色體畸變類型主要以斷裂、斷片為主,一般正常小鼠精原細(xì)胞畸變率為0.8%~3.4%。從表5看出,紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組與陰性對照組間差異不顯著(P>0.05),細(xì)胞畸變率陽性對照組與陰性對照組間差異極顯著(P<0.01),表明紅曲磷蝦油軟膠囊對小鼠精原畸變試驗為陰性。

        表5 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下小鼠的精子畸變情況

        2.3 28 d喂養(yǎng)試驗

        2.3.1 行為體征等 28 d喂養(yǎng)試驗期間紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的外觀形態(tài)與對照組無明顯差異,生長良好,未發(fā)現(xiàn)異常行為和體征,未出現(xiàn)明顯中毒癥狀和死亡。從表6看出,紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠體重增重、總進(jìn)食量、總食物利用率與對照組間差異不顯著(P>0.05),表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠行為特征無影響。

        表6 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的增重、食物總利用率(n=10)

        2.3.2 血液學(xué)及血液生化指標(biāo) 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量灌胃大鼠28 d,血液紅細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計數(shù)及其分類等指標(biāo),均滿足方差齊要求。從表7、表8看出,紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量組的各項指標(biāo)與陰性對照間無顯著差異(P>0.05),表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠血液學(xué)及血液生化各項指標(biāo)無影響。

        表7 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的生血液學(xué)指標(biāo)(n=10)

        表8 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的血液指標(biāo)(n=10)

        2.3.3 尿液與臟體指標(biāo) 從表9、表10看出,紅曲磷蝦油軟膠囊各劑量組大鼠的尿液、禁食后體重、臟體比等指標(biāo)與陰性對照組間無顯著差異(P>0.05),表明紅曲磷蝦油軟膠囊對大鼠尿液、臟體指標(biāo)無影響。

        表9 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的尿液指標(biāo)(n=10)

        表10 紅曲磷蝦油軟膠囊不同劑量下大鼠的臟體指標(biāo)(n=10)

        2.3.4 病理組織學(xué) 大鼠解剖肉眼未見異常。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例腎輕度淤血、1例胃炎細(xì)胞浸潤,雄鼠有1例肝小葉炎細(xì)胞浸潤、1例脾色素沉積,其余組織均未見異常;陰性對照組雌鼠有1例輕度肝小葉空泡變、1例胃黏膜輕度水腫,雄鼠有1例腎皮質(zhì)部腎小管空泡變、1例胃炎細(xì)胞浸潤,其余組織均未見異常。紅曲磷蝦油軟膠囊高劑量組(恢復(fù)期)雌鼠有1例肝小葉顆粒變性,雄鼠1睪丸間質(zhì)水腫;陰性對照組(恢復(fù)期)雄鼠1例肝少量炎細(xì)胞浸潤、1例肝小葉空包變、1例腎皮質(zhì)部腎小管腫脹,雌鼠1例胃少量炎細(xì)胞浸潤。以上病理學(xué)僅在個別大鼠中發(fā)生,各組病理變化無明顯差異,表明被檢臟器未見與紅曲磷蝦油軟膠囊有關(guān)的病理學(xué)改變。

        3 結(jié)論

        紅曲磷蝦油軟膠囊是由紅曲粉、南極磷蝦油以及玉米油配比,按照軟膠囊工藝制成的一款具有降血脂功能的保健食品。研究結(jié)果表明,紅曲磷蝦油軟膠囊以18.43 g/kg體重灌胃大鼠無中毒、死亡癥狀,表明此產(chǎn)品LD50大于18.43 g/kg,按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15193.3—2014),此膠囊屬于無毒級。細(xì)菌回復(fù)突變試驗、小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗、小鼠精原細(xì)胞畸變試驗結(jié)果均為陰性,表明紅曲磷蝦油軟膠囊無遺傳毒性。28 d喂養(yǎng)試驗的大鼠各項檢驗指標(biāo)均未發(fā)現(xiàn)明顯改變,說明紅曲磷蝦油軟膠囊安全無毒。下一步將對該產(chǎn)品的降血脂功能進(jìn)行驗證,完善該產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),為產(chǎn)品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

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