余鎂霞 鄧浩東 譚景艾 宋貴廷 吳光亮 陳利平劉睿琦 鄒安東 賀浩華,2 邊建民,2

（1作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部/江西省重點實驗室，330045，江西南昌；2江西省水稻高水平工程研究中心，330045，江西南昌）

水稻起源于熱帶和亞熱帶，對低溫敏感。隨著人口數(shù)量的增加，對水稻的需求量增加，導(dǎo)致水稻種植面積不斷向高緯度低溫地區(qū)擴展[1]。低溫不僅影響水稻內(nèi)部代謝物的產(chǎn)生，如脯氨酸、蔗糖和活性氧等，還會影響根和芽的形態(tài)[2]。水稻主要依靠根和芽的通氣組織輸送氧氣[3]，根和芽發(fā)育不良會使植株整體缺氧，不利于產(chǎn)量形成。因此，在低溫條件下，研究水稻萌發(fā)期根和芽的遺傳機制對培育耐冷優(yōu)良品種和促進水稻生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)作用。

水稻耐冷性是一個復(fù)雜的數(shù)量性狀，可以通過較多指標衡量[4-5]。迄今為止，已通過存活率、發(fā)芽率、發(fā)芽力、種子活力等指標定位到多個與水稻耐冷相關(guān)的QTL，如qCTS12[6]、qLTG3-1[7]、COLD-1[8]、qLTB3[9]和qCTB7[10]等。但對衡量水稻耐冷性重要指標的根長和芽長的研究相對較少。

在水稻根系眾多性狀中，根長是一個能反映水稻在逆境條件下生長發(fā)育健壯程度的重要指標。Steele等[11]在灌溉和干旱脅迫處理下以近等基因系（near-isogenic line，NIL）為材料，在第9號染色體 RM242-RM201間定位到 1個根長 QTL。Shimizu等[12]在磷缺乏的條件下，以秈稻品種Kasalath和粳稻品種日本晴構(gòu)建的染色體片段置換系（chromosome fragment replacement line，CSSL）群體為材料，在第 6號染色體定位到影響根長的QTLqREP-6。Mitsuhiro等[13]通過更換以 NH4+為唯一氮源的營養(yǎng)液建立適合量取根長的生長條件，利用粳稻品種 Koshihikari和秈稻品種 Kasalath雜交衍生出的CSSL，在第6號染色體檢測出控制根長的QTLqRL6.1。Wang等[14]利用短根保持系協(xié)青早B和長根恢復(fù)系 R9308雜交獲得的重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，在第7號染色體檢測到影響根長的QTLqRL7。徐曉明等[15]以超級稻協(xié)優(yōu) 9308衍生 RIL群體與輪回親本中恢9308回交多代的高代回交群體，在第4號染色體定位到影響根長的QTLqRL4。趙春芳等[16]在低磷條件下，以 9311為背景親本、日本晴為供體親本衍生的染色體片段置換系為材料，在第5號染色體定位到1個與根長相關(guān)的QTL。

與根長相比，芽長作為另一個反映水稻生長發(fā)育健壯程度的重要指標，前人對其研究甚少。Redona等[17]利用粳稻Labelle和秈稻Black Gora衍生的RIL群體，在18℃和25℃溫度條件下，定位到4個影響芽長的QTL。Fukuda等[18]通過秈稻和粳稻雜交的近交系在低溫16℃條件下，檢測到改善芽生長的QTLqSL3和qSL8。Zhang等[19]利用粳稻Lemont和秈稻Teqing雜交衍生的RIL，在18℃條件下定位到4個影響芽長的主效QTL。此外，班超等[20]通過整理水旱條件下水稻根系性狀QTL，得到水稻第1、2、3、5和11號染色體共11個區(qū)域很可能存在“一因多效”位點。這表明水稻根和芽可能存在協(xié)調(diào)發(fā)育的可能。但是對水稻根長和芽長的遺傳表型及其二者關(guān)系，特別是低溫條件下的關(guān)系知之甚少。

基于此，本研究利用9311（受體）/日本晴（供體）衍生的CSSL群體，在正常溫度（25℃）和低溫（15℃）條件下，分析水稻萌芽期根長和芽長的遺傳表現(xiàn)，并定位其中影響水稻萌芽期根長和芽長QTL。同時分析QTL間的關(guān)系，為后續(xù)研究其遺傳機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從受體親本秈稻 9311和供體親本粳稻日本晴雜交、回交的后代群體中選出121個性狀穩(wěn)定的株系，利用全基因組重測序技術(shù)進行基因分型，獲得高質(zhì)量的Bin標記；同時結(jié)合JoinMap 4.2軟件構(gòu)建CSSL群體的高密度圖譜。

1.2 試驗方法

從親本和每個株系所收獲的種子中選取 40粒飽滿健康的種子，經(jīng)3.5%次氯酸鈉消毒后，用蒸餾水漂洗干凈。隨后將種子置于底部放有一層濾紙的9cm無菌培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入恰好浸沒種子的蒸餾水。并放置于28℃條件下催芽。待種子萌發(fā)后，選擇其中整齊一致的30粒種子，置于15℃、12/12h（晝/夜）恒溫培養(yǎng)箱處理 7d，然后在 25℃恢復(fù)生長7d，期間每天隨機選取10粒幼芽測量根長（cm）和芽長（cm），測量后放回培養(yǎng)皿。

1.3 統(tǒng)計分析

采用 IciMapping V4.2軟件完備區(qū)間作圖法（ICIM）對 CSSL群體進行數(shù)據(jù)分析和 QTL定位[21-22]。QTL按照q+目標性狀+所在染色體號數(shù)或連鎖群代號原則命名，名稱用斜體[23-24]。用 SPSS 22.0與Excel 2017進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

利用多態(tài)性標記對 CSSL群體基因型進行劃分，與日本晴相同的基因型轉(zhuǎn)化為標記2，與9311相同的基因型轉(zhuǎn)化為標記0，無法判斷的基因型轉(zhuǎn)化為標記-1。以100kb為一個bin窗口，滑動所有子代樣品的每條染色體，根據(jù)每個樣品基因型來源，以 bin為單位得到該群體每個子代 marker信息，最終獲得655個Bin標記（表 1）。利用這些Bin標記構(gòu)建染色體片段置換系圖譜，其中約97%的基因組被日本晴片段置換覆蓋（圖1）。

圖1 染色體片段置換系圖譜基因型圖示Fig.1 Graphical genotypes of the CSSLs

表1 染色體標記數(shù)及bin間遺傳距離Table 1 The bin marker numbers and genetic distance between adjacent bins Mb

2.2 2個溫度下親本和CSSL群體表型分析

由表2得，15℃條件下，2個親本根長在第1天和第2天、芽長在第6天和第7天存在顯著差異，其余生長時期2個親本根長或芽長差異不顯著。25℃條件下，2個親本的根長在第1、2、3、4天、芽長在第3、4、5、6天存在顯著差異，其余生長時期差異不顯著。CSSL群體中，幼芽根長和芽長均表現(xiàn)出不同程度的差異，在2個溫度條件下均呈現(xiàn)連續(xù)變異，具有廣泛的變異幅度，均表現(xiàn)出明顯的超親分離現(xiàn)象（表2和圖2）。表明15℃和25℃條件下，水稻幼芽的根長和芽長表現(xiàn)出明顯的數(shù)量性狀特征，符合QTL定位要求。

圖2 15℃和25℃處理下CSSL群體表型分布Fig.2 Phenotypic distribution of CSSL population at 15℃ and 25℃

表2 親本及CSSL群體在2個溫度條件下根長和芽長表型分析Table 2 Phenotype analysis of root length and bud length under two temperatures of their parents and CSSL population

2.3 2個溫度條件下根長和芽長的QTL定位

2個溫度條件下共定位32個QTL。其中，18個QTL與根長相關(guān)，14個QTL與芽長相關(guān)。這些QTL分布在水稻的第1、2、3、6～12號染色體上，貢獻率為0.58%～38.26%。大部分QTL（75%）分布在水稻的第3、7～10號染色體（表3和圖3）上。有9個QTL增效等位基因來自日本晴，其余均來自9311。

圖3 CSSL群體定位的2個溫度處理后影響根長和芽長QTL染色體分布Fig.3 Distribution of QTL related root length and bud length on genetic map under two temperature treatments of CSSL population

表3 CSSL群體定位2個溫度條件下幼芽生長不同時期影響根長和芽長的QTLTable 3 QTL mapping for root length and bud length under two temperatures using CSSL population at different stages of sprout growth

2.3.1 15℃條件下 QTL定位 15℃條件下，共定位到 9個根長 QTL：qRL15T2.1、qRL15T7.1、qRL15T7.2、qRL15T7.3、qRL15T10.1、qRL15T10.2、qRL15T10.3、qRL15T10.4和qRL15T10.5，貢獻率為8.66%～24.36%。其中，qRL15T7.2和qRL15T10.3在不同時期被重復(fù)檢測到。除qRL15T2.1增效等位基因來自于日本晴外，其余均來自9311。

15℃條件下，定位到9個芽長QTL，分別位于第 1～3、6～10號染色體上，貢獻率為 1.73%～28.90%，其中qBL15T6、qBL15T7、qBL15T9和qBL15T10被重復(fù)檢測到。qBL15T3.1、qBL15T3.2、qBL15T7和qBL15T10促進芽生長的等位基因來自9311，而qBL15T1、qBL15T2、qBL15T6、qBL15T8和qBL15T9促進芽生長的等位基因來自日本晴。

2.3.2 25℃條件下 QTL定位 25℃條件下，在 6條染色體共檢測到9個影響根長的QTL，貢獻率為5.22%～12.82%。所有位點上促使根生長的等位基因均來自9311。qRL25T7、qRL25T9.3、qRL25T10和qRL25T12被重復(fù)檢測到。

25℃條件下，有5個影響芽長的QTL被檢測到。其中qBL25T11位于第 11號染色體上，qBL25T3.1、qBL25T3.2、qBL25T3.3和qBL25T3.4分布于第3號染色體。QTL貢獻率為0.58%～38.26%。只有qBL25T3.3在芽生長不同時期被重復(fù)檢測到。除qBL25T3.1促進芽生長的等位基因來自9311，其余位點增效等位基因均來自日本晴。

2.4 多效性QTL分析

由表4可知，第2、7、9、10號染色體的4個Bin標記區(qū)域存在同一溫度影響不同性狀或不同溫度影響不同性狀的位點。標記bin113、bin393和bin507所在的位點在15℃條件下對根長和芽長生長均有影響，這3個位點的增效等位基因均來自9311。標記bin448所在的位點對15℃芽長和25℃根長產(chǎn)生影響，其等位基因分別來源于日本晴和9311。

表4 對性狀有多效性的染色體標記對應(yīng)區(qū)域Table 4 Chromosomal markers corresponding to regions with pleiotropic effects on traits

3 討論

3.1 芽期低溫脅迫后水稻恢復(fù)生長的遺傳機制

為探究芽期低溫脅迫后水稻恢復(fù)生長的遺傳機制，本研究利用 9311/日本晴衍生的CSSL群體在低溫（15℃）和正常溫度（25℃）下對根長和芽長進行了分析。結(jié)果顯示，不同親本在同一溫度下存在差異。CSSL群體根長和芽長在萌發(fā)期不同階段均表現(xiàn)出連續(xù)變異，表明低溫和正常溫度下水稻根長和芽長均表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳。此外，在幼芽生長不同階段，只有少數(shù) QTL被重復(fù)檢測到，并且在不同時期其加性效應(yīng)值不同，表明水稻幼芽期不同階段基因是選擇性表達，其耐低溫性受多個QTL（基因）控制，這與陳利華等[25]研究結(jié)果類似。

2個溫度條件下，生長前期9311根長顯著長于日本晴，后期由于粳稻日本晴生長速度加快[26-27]，根長差異不顯著。生長前期2個親本間芽長無顯著差異，生長后期 15℃條件下日本晴芽長顯著長于9311，25℃條件下表現(xiàn)不明顯，這可能與粳稻耐冷性強有關(guān)。在同一生長時期，2個溫度條件下所定位的 QTL均不同，即低溫和正常溫度下，控制水稻芽期生長的基因（QTL）均存在差異，表明低溫處理后，幼芽恢復(fù)生長遺傳機制與常溫條件下正常生長可能存在差異。

3.2 定位的根長和芽長QTL比較

25℃條件下，檢測到9個影響根長的QTL，其等位基因均來自于9311，其中影響最大的QTL為qRL25T9.3（LOD值16.75，貢獻率44.89%）；檢測到5個影響芽長的QTL，其中影響最大的QTL為qBL25T3.3（LOD 值 51.60，貢獻率 43.86%），除qBL25T3.1外，其余QTL位點增效等位基因均來自于日本晴。結(jié)果表明，常溫條件下2個親本等位基因?qū)ΩL和芽長均產(chǎn)生主要影響。15℃條件下，檢測到9個影響根長的QTL，其中影響最大的QTL為qRL15T10.3（LOD值9.77，貢獻率31.63%），除qRL15T2.1外，其余QTL位點增效等位基因均來自于9311；檢測到9個影響芽長的QTL，qBL15T3.1、qBL15T3.2、qBL15T7和qBL15T10中增效等位基因來自于 9311，而qBL15T1、qBL15T2、qBL15T6、qBL15T8和qBL15T9中增效等位基因來自于日本晴，其中影響最大的 QTL為qBL15T10（LOD值61.39，貢獻率 64.37%），其增效等位基因來源于9311。結(jié)果表明，秈稻 9311中也存在耐低溫的基因。盡管較多的研究表明粳稻較秈稻耐冷，特別是幼苗期和抽穗揚花期，但Fujino等[28]和Miura等[29]研究結(jié)果表明，秈稻芽期耐冷性強于粳稻，同時定位了多個秈稻芽期耐冷QTL，這與本研究結(jié)果較一致，表明秈稻和粳稻中可能均存在耐冷的基因。因此，可以聚合這些耐低溫的基因（QTL），并通過分子標記輔助選擇技術(shù)將其轉(zhuǎn)入到其他秈稻品種中，使其根和芽能夠更好地在低溫環(huán)境下生長。

本研究共定位了到 32個影響幼芽生長的QTL。其中qRL15T2.1（19.75～20.75 Mb）與 Courtois等[30]定位到影響每蘗根重QTL（RG171-RG157）位置接近。qRL25T1（35.9～38.35 Mb）與Zheng等[31]定位控制根粗（RZ730-RZ801）的QTL位置相近。徐吉臣等[32]（C711-G103）研究中也曾提及，qRL25T9.1（6.5～7.25Mb）所在位點控制最大根長。qRL25T9.3（20.6～21.05Mb）所在位點分別影響水稻生長后期根中木質(zhì)部血管數(shù)目及移栽后生根[33-34]。在qBL25T3.2位置分別定位到控制苗長的OsMRP5和oni1[35-36]。此外，目前暫未發(fā)現(xiàn)與其他位點相同或接近的與根和芽相關(guān)性狀的QTL。這些QTL的定位為解析水稻芽期遭遇低溫冷害后恢復(fù)生長的遺傳機制提供了參考。通過聚合這些 QTL使水稻在芽期遭遇低溫后更快地恢復(fù)生長。

3.3 多效性QTL分析

本研究表明，2個溫度條件下，根和芽的生長相互影響。本試驗發(fā)現(xiàn)標記區(qū)域bin113（qRL15T2.1和qBL15T2）、bin393（qRL15T7.3和qBL15T7）及bin507（qBL15T10和qRL15T10.4）同時在15℃條件下對根長和芽長恢復(fù)生長有影響，bin448（qBL15T9和qRL25T9.2）對15℃芽長和25℃根長有影響，為多效性QTL，影響根和芽的協(xié)同發(fā)育。因此將其視為根和芽協(xié)調(diào)發(fā)育中的多效QTL[37]。

4 結(jié)論

以9311（受體）/日本晴（供體）CSSL群體為材料，在15℃低溫處理后，共檢測到9個影響根長及9個影響芽長的QTL。以25℃為對照，共檢測到 9個影響根長及 5個影響芽長的 QTL。除qRL15T2.1、qRL25T1、qRL25T9.1、qRL25T9.3及qBL25T3.2外，其余均可能是新的影響根和芽生長的QTL。同時，在第2、7、9和10號染色體上4個Bin標記區(qū)域檢測到影響根和芽協(xié)調(diào)發(fā)育的多效性QTL。此外，在15℃定位的根長或芽長QTL與在25℃定位的根長或芽長QTL均不相同，表明低溫條件下控制水稻幼芽期根和芽生長的遺傳機制可能與常溫下不同。