李 安 舒健虹 劉曉霞 蒙正兵 王小利 趙德剛

（1貴州大學生命科學學院（農(nóng)業(yè)生物工程研究院）/山地植物資源保護與種質創(chuàng)新教育部重點實驗室/山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，550025，貴州貴陽；2貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所，550006，貴州貴陽）

玉米是我國重要的糧飼作物，可作為工業(yè)原料、食品和牲畜飼料，在糧飼生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結構方面發(fā)揮著重要作用，所以玉米產(chǎn)量影響著國家糧食安全。玉米對水分敏感，水分已成為制約玉米產(chǎn)量的重要生態(tài)因子，而對于多數(shù)作物而言，干旱脅迫反應敏感的關鍵時期都是芽苗期[1]，干旱脅迫下往往能造成作物種子幼苗的根系、葉片等形態(tài)學特征發(fā)生變化，出現(xiàn)葉面積減小、植株變矮的現(xiàn)象，從而使玉米生長不足、產(chǎn)量低[2]，所以提高玉米抗逆性是提高產(chǎn)量的有效方式。研究表明，依賴植物的根際促生菌（PGPR）可以增強作物的抗逆性，王孝先等[3]對砂生槐根際促生菌的篩選及干旱脅迫對其種子萌發(fā)和幼苗生長的研究表明，接種菌株的促生效果優(yōu)良，同時又增強了種子抗旱性?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis）屬PGPR，其生理特征豐富多樣，極易分離培養(yǎng)，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，可用來研究PGPR與植物的共生關系。枯草芽孢桿菌應用于植物病害生物防治的研究已經(jīng)有多年歷史，目前在黃瓜[4-5]、辣椒[6-7]、水稻[8-9]、小麥[10-12]和玉米[13-15]等作物病害上表現(xiàn)出較好的防治效果[15]。近年來，科學家們從枯草芽孢桿菌產(chǎn)生拮抗物質的類型、分子作用機理及田間應用等方面開展了廣泛而深入的研究，為進一步明確枯草芽孢桿菌的作用機制和作用效果提供了科學依據(jù)。枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的細胞素對霉菌和酵母細菌有一定的抑制作用；其產(chǎn)生的酶類可以消解病原菌的細胞壁；以及活性蛋白質能夠溶解細胞壁，造成菌絲畸形，孢子不發(fā)芽或者異常[15]。與此同時，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生生長激素，如生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸和乙烯等，促進植物生長，繼而改善農(nóng)作物生長發(fā)育[16-17]。利用植物激素是調控植物抗旱能力的手段之一[18]。因此，研究干旱脅迫下枯草芽孢桿菌菌種對玉米萌發(fā)的生理調節(jié)作用對于生物菌肥的開發(fā)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試玉米種子為金玉818，由貴州省農(nóng)業(yè)科學院旱糧研究所提供，枯草芽孢桿菌菌種為貴州省野外采集實驗室保存（表1）。

表1 試驗菌種來源及編號Table 1 Source and number of tested bacteria

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種制備 將 4個菌種培養(yǎng)擴增，調節(jié)OD600值至0.9左右，離心，取沉淀用于菌種試驗。

1.2.2 種子預處理 將玉米種子用10%次氯酸鈉溶液消毒20min，再用無菌水洗滌3～5遍，自然晾干后備用。

1.2.3 試驗處理 設置10個處理，分別為20mL無菌水+菌種（編號A1、B1、C1、D1）、20mL 15%PEG+菌種（編號A2、B2、C2、D2）以及20mL無菌水（CK1）和20mL 15% PEG（CK2）。準備鋪有2張濾紙的滅菌培養(yǎng)皿，取45粒外觀均勻良好的玉米種子置于上述培養(yǎng)皿中。每個處理 3次重復，從處理時間起，每日記錄發(fā)芽數(shù)，直至不再發(fā)芽為止。

1.3 測定指標及方法

自播種起每日記錄發(fā)芽數(shù)以及發(fā)霉數(shù)，發(fā)芽結束后，測定根長、根數(shù)、幼苗鮮重、根鮮重、芽鮮重、總生物量、根冠比等發(fā)芽指標，然后放置于烘箱 105℃烘 24h，稱量芽與根干重。測定相對含水量、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)，同時測定芽葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性以及丙二醛（MDA）和葉片游離脯氨酸（Pro）含量。

計算公式：發(fā)芽率（GR）=7d內發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)；發(fā)芽勢（GP）=3d內發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)；發(fā)芽指數(shù)（GI）=Σ(Gt/Dt)，Gt為第t天發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)；活力指數(shù)（VI）=GI×SL；SL 為幼苗鮮重；幼苗含水量（%）=（SL-G）/SL×100，G為幼苗干重；

采用SOD抑制氮藍四唑（NBT）光化還原法[19]測定 SOD活性；采用紫外吸收法[20]測定 CAT活性；采用磺基水楊酸法[21]測定Pro含量；采用硫代巴比妥酸法[22]測定MDA含量；采用愈創(chuàng)木酚法[23]測定POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用下列公式計算隸屬函數(shù)值、抗旱性量度值和加權抗旱指數(shù)。

隸屬函數(shù)值：

標準差系數(shù)：

權重系數(shù)：

抗旱指數(shù)：

抗旱性量度值：

式中，Xij和Xj分別表示第i處理第j個指標的隸屬值和所有株系第j個指標的平均值；Xmin和Xmax分別表示第j個指標的最小值和最大值；m與n分別表示指標的個數(shù)和處理數(shù)。耐旱系數(shù)（PI）=不同處理下測定平均值/對照測定值；計算隸屬函數(shù)值時，指標與耐旱性呈正相關時使用公式(1)，指標與耐旱性呈負相關時用公式(2)。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下不同菌種處理對玉米種子萌發(fā)及幼苗含水量的影響

由表1可知，除B1外，正常無干旱脅迫下，各菌液處理下發(fā)芽率均顯著高于CK1，B1處理下種子發(fā)芽指數(shù)以及A1活力指數(shù)顯著低于CK1，其余發(fā)芽指標均與CK1差異不顯著。干旱脅迫下，各菌液處理發(fā)芽勢均顯著高于CK2，除B2處理，其余各處理發(fā)芽率均顯著高于CK2，A2發(fā)芽指數(shù)顯著高于CK2。在活力指數(shù)方面，D2活力指數(shù)顯著（P＜0.05）高于其他處理，其余各處理間差異不顯著，各處理幼苗含水量差異不顯著。干旱處理萌發(fā)指標較正常情況有不同程度降低。

2.2 干旱脅迫下不同菌種處理對玉米發(fā)芽指標的影響

由表3可知，與CK1相比，B1、C1和D1處理下的芽長、根長、根數(shù)、總生物量干重、芽干重和芽鮮重等生長指標顯著提高，根冠比顯著降低，根干重差異不顯著；B1、C1處理下，根鮮重顯著高于CK1，A1處理根干重和根冠比顯著低于CK1。干旱脅迫下，D2處理下玉米根長、總生物量干重、芽干重與根鮮重均顯著高于CK2，A2、B2和C2處理的根長與CK2之間差異不顯著。B2、C2和D2處理的芽長、根數(shù)、根干重與根冠比等萌發(fā)期生長指標與CK2差異不顯著，而A2處理下芽長顯著低于CK2。整體來說，不同枯草芽孢桿菌處理對玉米萌發(fā)期相關指標存在不同的影響，其中D2處理有更強的優(yōu)勢。

表2 不同處理對玉米種子萌發(fā)及幼苗含水量的影響Table 2 Effects of different treatments on seeds germination and seedling water contents of maize

表3 不同處理對玉米生長相關指標影響Table 3 Effects of different treatments on corn related growth indexes

2.3 干旱脅迫下隸屬函數(shù)值和標準差系數(shù)賦予權重法分析

不同菌種處理下，運用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)公式對玉米種子萌發(fā)過程中的抗旱性各指標進行標準化處理，并且利用標準差系數(shù)賦予權重法對各指標賦予權重，從而定量地比較株系間的抗旱能力。由表4可知，各菌種處理下玉米萌發(fā)過程抗旱性為D2＞B2＞C2＞A2＞CK2。進一步對D值和各發(fā)芽指標進行相關性分析，結果（表5）顯示，D值與玉米萌發(fā)活力指數(shù)、根長、幼苗含水量等指標呈顯著的正相關關系，除根干重與根冠比外與其他指標呈正相關關系。由此，D值既考慮各指標的重要性，又考慮了各指標間的相互關系，因此，用D值綜合評價抗旱性較為全面和準確。

表4 干旱脅迫下玉米萌發(fā)抗旱綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of maize germination drought resistance under drought stress

表5 干旱脅迫下玉米萌發(fā)指標相關性分析Table 5 Correlation analysis of maize germination indexes under drought stress

2.4 干旱脅迫下不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中SOD、CAT和POD活性的影響

由圖1所示，與非干旱脅迫相比，干旱脅迫下玉米萌發(fā)過程中的抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性都呈現(xiàn)出增加的趨勢，而干旱脅迫與非干旱脅迫接種枯草芽孢桿菌菌體顯著降低了SOD、CAT和POD的活性。值得注意的是，干旱脅迫與非干旱脅迫接種菌劑對于POD活性的影響較小，其中B與D干旱脅迫處理下顯著降低了POD活性，而接種菌劑處理下，SOD和CAT活性都呈現(xiàn)出顯著降低的趨勢。這表明干旱脅迫下玉米抗氧化酶SOD、CAT和POD活性都得到提高以應對干旱對植物的損傷，接種菌劑降低了干旱脅迫對酶活性的影響。

圖1 不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中SOD、CAT及POD活性的影響Fig.1 Effects of different strains treatments on the activities of SOD, CAT and POD during corn germination

2.5 干旱脅迫下不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中滲透物質Pro含量的調節(jié)

干旱脅迫與非脅迫下及不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中滲透物質Pro含量的調節(jié)存在差異。由圖2a所示，干旱脅迫下，玉米萌發(fā)過程中芽尖 Pro含量明顯提高以增加細胞內滲透物質含量，防止細胞內水分子的流失。其中接種枯草芽孢桿菌 D的玉米芽尖 Pro含量顯著高于對照組與其余各枯草芽孢桿菌處理，而在非脅迫下除接種枯草芽孢桿菌A以外，其余各菌株均能提高玉米芽尖的Pro含量。

2.6 干旱脅迫下不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中MDA含量的調節(jié)

如圖2b所示，干旱脅迫與非脅迫下不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中滲透物質Pro和芽尖MDA含量的調節(jié)趨勢并不一致，在非干旱脅迫下，接種枯草芽孢桿菌的A1、B1和C1處理顯著高于對照組玉米芽尖的MDA含量。值得注意的是，接種枯草芽孢桿菌D顯著提高了玉米芽尖的Pro含量，但玉米芽尖的MDA含量與對照組差異并不顯著，且低于接種A、B和C菌種。在干旱脅迫下，對照組MDA含量顯著高于接種枯草芽孢桿菌的處理，其中接種D菌種的處理顯著低于其余各處理。整體而言，干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌降低了玉米芽尖的MDA含量，其中接種枯草芽孢桿菌D的下降幅度最大。

圖2 不同菌種處理對玉米萌發(fā)過程中滲透物質Pro與MDA含量的影響Fig.2 The effects of different strain treatments on the contents of osmotic substance Pro and MDA during corn germination period

3 討論

發(fā)芽率、發(fā)芽勢和種子活力指數(shù)反映植物種子發(fā)芽速度、發(fā)芽整齊度和幼苗健壯的趨勢，常作為評價種子發(fā)芽的指標[24]。本研究表明，接種枯草芽孢桿菌能夠提高玉米發(fā)芽率及發(fā)芽勢，不同菌種處理具有一定差異。C菌種處理能夠提高玉米種子的發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)；干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌A有利于提高玉米種子發(fā)芽指數(shù)，而接種枯草芽孢桿菌D有利于提高其活力指數(shù)。根系是植物吸收水分的最主要的器官，對外界環(huán)境水分的變化反應極為敏感，水分脅迫下根系形態(tài)會發(fā)生變化。本試驗中測定干旱脅迫與非脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)期的根長、芽長、根鮮重、芽鮮重、根干重和芽干重等發(fā)芽指標，并對玉米各項發(fā)芽指標進行干旱脅迫下隸屬函數(shù)和標準差系數(shù)賦予權重法分析，將不同的發(fā)芽指標進行綜合運算，通過其結果加權抗旱指數(shù)、隸屬函數(shù)均值、D值，從而綜合評價干旱脅迫與非脅迫下接種不同枯草芽孢桿菌菌種對玉米萌發(fā)的影響。此方法在魏波等[25]進行的 PEG模擬干旱條件下紅花種子萌發(fā)特性的比較研究中用到。D值是對各個玉米發(fā)芽指標的綜合評價，并通過D值與玉米各項指標之間的相關性分析，發(fā)現(xiàn)D值與玉米萌發(fā)活力指數(shù)、根長、根數(shù)等指標呈顯著正相關關系，與其他指標呈正相關關系。而根據(jù)加權抗旱指數(shù)、隸屬函數(shù)均值和D值的綜合評價結果可知，干旱脅迫下，各菌種處理玉米萌發(fā)過程抗旱性為D2＞B2＞C2＞A2＞CK2，干旱脅迫環(huán)境下接種枯草芽孢桿菌提高了玉米種子萌發(fā)過程中的抗逆性。

干旱脅迫下，植物會因缺水而受到傷害，甚至死亡。為了適應或抵抗缺水的不利環(huán)境，植物形成了從表型特征變化、生理生化響應等應激方式來維持自身的水分狀況，以避免或減輕缺水對植物的傷害[26]。從形態(tài)上具體表現(xiàn)為植株矮化、葉片角質層增厚、氣孔下陷、氣孔關閉、根系更為發(fā)達、根冠比增高、蒸騰面積減??；植物通過表型特征變化有效增加水分吸收量，同時降低水分散失；生理生化響應機制可分為2類，一是通過積累可溶性糖、可溶性蛋白、Pro等滲透物質調節(jié)細胞內滲透壓，防止水分子的損失，同時能量消耗也降低，使植物抗逆性增強，這是植物適應干旱脅迫的重要方式[27-29]。本研究中干旱與非干旱脅迫下接種不同枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)過程中Pro的積累結果顯示，接種枯草芽孢桿菌在干旱與非干旱脅迫下都提升了Pro的含量，且干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌玉米萌發(fā)過程中Pro的積累情況與抗旱評價相印證，即D2＞B2＞C2＞CK2；二是干旱脅迫下，植物抗逆性增強同時還表現(xiàn)在植物非酶促反應與酶促反應方面。酶促反應系統(tǒng)主要為SOD、POD和CAT等一系列復雜的過程與酶調控植物體內活性氧代謝維持著動態(tài)平衡[30-31]。作為系統(tǒng)性的調節(jié)，單一的抗氧化酶或抗氧化物并不足以防御活性氧脅迫對植物的傷害，它們需要協(xié)同作用以共同抵抗干旱脅迫引起的氧化傷害。在干旱脅迫下，抗旱性強的植物體內SOD、POD和CAT的活性一般較高，因而能夠有效清除植物體內活性氧，抑制膜脂過氧化，緩解植物因干旱脅迫受到的傷害。雖然發(fā)現(xiàn)干旱脅迫與抗氧化酶活性之間存在顯著的相互作用，但PGPR菌株處理往往會降低干旱脅迫對酶活性的影響[32]。在枯草芽孢桿菌處理下，玉米種子SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性降低。干旱與非干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌的玉米芽尖 SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性變化一致。

通過測定 MDA含量可判斷植物細胞受脅迫損傷程度，MDA是膜脂過氧化的主要降解產(chǎn)物，可導致細胞結構的破壞以及功能的喪失。干旱條件下，MDA含量會隨著脅迫程度加重而增加是判斷植物抗旱性的重要指標[33-34]。本試驗在干旱與非干旱脅迫下接種不同的枯草芽孢桿菌，通過測定玉米芽尖的MDA含量，發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌的玉米在非脅迫下與對照組差異較小，且各處理間差異也較小。但是干旱脅迫下接種枯草芽孢桿菌使玉米芽尖MDA含量有顯著性的降低，其中接種枯草芽孢桿菌D的玉米芽尖MDA含量最低，體現(xiàn)出接種枯草芽孢桿菌能夠提高玉米在干旱脅迫下的抗逆性。

4 結論

各菌種處理下玉米萌發(fā)過程抗旱性表現(xiàn)為R60＞R9-1＞R59＞R29-1＞CK2。接種枯草芽孢桿菌能提升玉米萌發(fā)過程的Pro含量，降低抗氧化酶SOD、CAT和POD活性，同時能夠有效減輕細胞膜受到的傷害，尤其接種枯草芽孢桿菌 R60效果更加顯著。選擇何種菌種進行微生物菌肥的生產(chǎn)需要對玉米生長各生育時期進行研究，從而優(yōu)選出更利于玉米產(chǎn)量增加的菌種。