王 翔，卓啟云，吳瑜凡，劉陽泰，李紅梅，董慶利

（1 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海200093 2 張家港海關(guān)綜合技術(shù)中心 江蘇蘇州215600 3 華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析測試中心 上海200237）

食源性疾病是我國突出的公共衛(wèi)生問題，致病來源的范圍大，導(dǎo)致人體患病的幾率高[1]。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在全球每年感染食源性疾病的15 億人口中，由食源性致病微生物引起的占70%[2]。食源性致病微生物包括細(xì)菌、真菌和病毒，其影響最大，涉及面最廣，引起疾病最多。常見的食源性致病菌有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、空腸彎曲菌、副溶血弧菌、志賀氏菌等。食源性致病菌感染人體后會導(dǎo)致多種疾病，如胃腸炎、腦膜炎和敗血癥等或者直接引起人體中毒，甚至死亡[3-4]。致病菌的致病能力與其生物學(xué)功能息息相關(guān)，如毒性大小決定細(xì)菌致病能力高、低；生物膜會提高細(xì)菌對不利環(huán)境條件的抗性；耐藥性降低抗生素對細(xì)菌的作用，從而提高細(xì)菌的存活能力。這些功能特性都給食源性致病菌的控制帶來極大的挑戰(zhàn)。食源性致病菌的生物學(xué)功能發(fā)揮作用主要由其基因決定，包括遺傳性基因序列和獲得性基因序列，如規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。

CRISPR 是細(xì)菌免疫防御系統(tǒng)的組成部分[5]，存在于45%的細(xì)菌基因組和87%的古細(xì)菌基因組[6]，在發(fā)揮作用時(shí)，通常有相關(guān)Cas 蛋白（CRISPR -associated proteins，Cas）的協(xié)助，CRISPR 和Cas 蛋白共同組成CRISPR-Cas系統(tǒng)，能有效抵御外源移動(dòng)原件的入侵，以維持自身遺傳信息的穩(wěn)定性和完整性[7]。CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制可分為3 個(gè)階段：細(xì)菌整合外源移動(dòng)遺傳元件的適應(yīng)階段（adaption），crRNA（CRISPR RNA）形成的表達(dá)階段（biogenesis），破壞再次入侵的外源移動(dòng)元件的干擾階段（interference）[8]。CRISPR-Cas系統(tǒng)新近的研究表明：其在細(xì)菌中具有基因表達(dá)調(diào)節(jié)的功能[8-9]。本文總結(jié)常見食源性致病菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能研究，為進(jìn)一步探索該系統(tǒng)攜帶的生物信息提供幫助，為深層次闡明該系統(tǒng)與食源性致病菌耐藥性、毒性等生物功能之間的關(guān)系提供參考。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種原核生物的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[10]，同時(shí)也是原核生物基因組中分布最廣的重復(fù)序列家族[11]。CRISPR 基因座于1987年首次在大腸桿菌中以重復(fù)序列的形式被觀察到[12]，2002年才正式命名為CRISPR[13]，由CRISPR 基因座和cas基因兩大部分組成。如圖1所示，CRISPR 基因座包括前導(dǎo)序列（Leader）、間隔序列（Spacers）、重復(fù)序列（Direct repeats，DR），間隔序列和重復(fù)序列交替排列形成R-S 結(jié)構(gòu)，是CRISPR 系統(tǒng)的重要作用部分；前導(dǎo)序列的長度在300～500 bp 范圍，是一段富含堿基A 和T 的序列，位于R-S 的上游，與第1 個(gè)重復(fù)序列相連，當(dāng)宿主整合外源移動(dòng)遺傳元件時(shí)，間隔序列插入第1 個(gè)重復(fù)序列和前導(dǎo)序列之間，前導(dǎo)序列種內(nèi)保守，種間差異；重復(fù)序列長度在21～37 bp 范圍，具有保守性，通常在序列兩端有堿基變化，重復(fù)序列即使在同種微生物，不同菌株間的數(shù)量也是不同的；發(fā)揮免疫作用的主要序列片段是間隔序列，與重復(fù)序列的長度相似，來源是外源核酸，以噬菌體和外源質(zhì)粒為主[13-14]。細(xì)菌有時(shí)為限制CRISPR 基因座的大小，會有刪除間隔序列的行為[15]。刪除的大多是位于CRISPR 的3' 端較保守的間隔序列[16]。Cas 蛋白是CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用不可或缺的一部分，主要發(fā)揮解旋酶、核酸酶等的作用，常見的Cas 蛋白有Cas1、Cas2、Cas3、Cas6、Cas9、Cas10、Csn1、Csn2，其中Cas1 和Cas2 均為核酸酶，在間隔序列整合階段發(fā)揮作用，存在于所有CRISPR-Cas系統(tǒng)中[15]。有研究者提出，Cas1 和Cas2 有可能在細(xì)菌感染噬菌體后通過引起細(xì)胞休眠來抵御噬菌體[17]。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型及其基本結(jié)構(gòu)（以單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為例）Fig.1 The types and basic structure of CRISPR-Cas system（Listeria monocytogenes as an example）

表1 常見食源性致病菌CRISPR-Cas系統(tǒng)特征Table 1 CRISPR-Cas system characteristics of common foodborne pathogens

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的功能

近年來，CRISPR-Cas 技術(shù)在高效基因編輯中的作用受到關(guān)注，其中以II 型系統(tǒng)CRISPR-Cas9在基因編輯技術(shù)應(yīng)用最廣泛。而CRISPR-Cas系統(tǒng)最初發(fā)現(xiàn)為原核細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[15]，具有抵御外源質(zhì)粒、噬菌體侵襲的功能；除此之外，新近研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌中還具備基因表達(dá)調(diào)節(jié)的功能[8-9]，包括調(diào)節(jié)細(xì)菌耐藥能力，控制細(xì)菌毒力，涉及生物膜形成等[35]。

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)和細(xì)菌耐藥性之間的關(guān)系

CRISPR-Cas系統(tǒng)占細(xì)菌基因組序列的1%，表明此系統(tǒng)在細(xì)菌的生存進(jìn)化中起重要作用[14]，其中關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng)和細(xì)菌耐藥性之間的關(guān)系已有廣泛研究。多數(shù)研究表明，當(dāng)細(xì)菌基因組中CRISPR 系統(tǒng)具有活性時(shí)，其毒性和耐藥性都相對較低，并在獲取毒性、耐藥性的過程中，丟失和主動(dòng)刪除CRISPR 結(jié)構(gòu)或使CRISPR 結(jié)構(gòu)失活（表2）。

Bikard 等[36]研究肺炎鏈球菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌在面對抗生素的強(qiáng)選擇性應(yīng)力時(shí)，會丟失基因組中的CRISPR 基因座以獲得抗生素抗性，若CRISPR-Cas系統(tǒng)的目標(biāo)核酸序列包含可以賦予菌株一些特征的基因序列，菌株則會自動(dòng)刪除CRISPR 基因座或使其失活以獲得相關(guān)特性。研究表明，沙門氏菌在獲取氟代喹諾酮類耐藥性時(shí)，CRISPR-Cas系統(tǒng)基因序列發(fā)生20 個(gè)堿基片段的插入和缺失，以及273 個(gè)單堿基位點(diǎn)的突變[37]，這一行為導(dǎo)致沙門氏菌CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫功能的缺失。間隔序列和目標(biāo)物之間只要有一個(gè)堿基不匹配，便可使CRISPR-Cas系統(tǒng)對外源移動(dòng)遺傳元件的抗性消失[5]。另外，前間隔序列（Protospacer）和前間隔序列鄰近序列（Protospacer adjacent motifs，PAMs）的保守性對該系統(tǒng)的抗性至關(guān)重要，單一核苷酸的改變能使噬菌體躲避CRISPR 免疫機(jī)制的作用[38]。相反地，有研究者指出間隔序列和目標(biāo)核酸的互補(bǔ)性很低[39]，堿基突變不能影響間隔序列和其目標(biāo)物匹配。cas基因?qū)χ虏【拿庖咦饔靡彩遣豢苫蛉钡?，CRISPR-Cas系統(tǒng)失活的方法中包括向cas基因中引入轉(zhuǎn)座子、使cas基因功能喪失等[8]。Palmer 等[40]研究表明糞腸球菌對氨芐西林的抗性增加，是由于基因序列中的CRISPR 基因座丟失。研究也發(fā)現(xiàn)糞腸球菌只有CRISPR 基因座，無Cas 蛋白，其基因組中抗生素耐藥基因仍十分豐富。此研究者還指出，9株腸球菌在缺失CRISPR-Cas系統(tǒng)的同時(shí)，也缺乏對抗生素的抗性，其中6 株腸球菌因無全基因組序列的詳細(xì)信息，故在它們的基因組中發(fā)現(xiàn)不同于現(xiàn)有3 種CRISPR-Cas系統(tǒng)的CRISPR 結(jié)構(gòu)的可能性，此結(jié)果與空腸彎曲菌的研究結(jié)果相同[40-41]。

劉興雨[42]在研究臨床分離的銅綠假單胞菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)CRISPR 陽性菌株對β-內(nèi)酰胺類抗生素亞胺培南的耐藥率低于CRISPR 陰性菌株。此現(xiàn)象并非絕對，對大腸桿菌CRISPR-Cas系統(tǒng)與耐藥性的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)：基因組含有CRISPR 基因座的菌株多重耐藥率明顯高于不含CRISPR 基因座的菌株，同時(shí)多重耐藥菌株和標(biāo)準(zhǔn)株cas基因的表達(dá)量差異并不顯著。研究表明大腸桿菌CRISPR 結(jié)構(gòu)和多重耐藥呈現(xiàn)出罕見的正相關(guān)[43]，其原因可能是因所選取菌株的差異性。某些大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR 陣列比較小，也較穩(wěn)定，因此CRISPR 結(jié)構(gòu)在近萬年的生存進(jìn)化中沒有顯著變化[44]。然而，在噬菌體的快速進(jìn)化過程中，大腸桿菌的CRISPR 陣列未發(fā)生明顯變化便無法阻止外源核酸的侵襲，攜帶耐藥基因的外源核酸直接整合到細(xì)菌基因組，這便解釋了CRISPR 結(jié)構(gòu)和多重耐藥同時(shí)存在的現(xiàn)象。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的耐藥性還能從其使細(xì)菌免于被噬菌體裂解方面來理解。噬菌體侵入宿主后，利用宿主內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)新陳代謝，并用氨基酸和堿基合成自身所需蛋白質(zhì)與核酸，將蛋白質(zhì)與核酸組裝在一起，從而使細(xì)菌裂解死亡，釋放出大量新的噬菌體。將噬菌體的遺傳物質(zhì)整合到自身基因組序列的細(xì)菌稱為溶原菌，其對同源噬菌體的侵入有免疫作用，且噬菌體的核酸可以隨著宿主細(xì)菌的分裂同步復(fù)制[45]，其分裂產(chǎn)生的細(xì)菌均對該種噬菌體免疫。CRISPR-Cas系統(tǒng)有明顯的弊端，即它具有攻擊宿主細(xì)菌的可能性。CRISPR 系統(tǒng)無法區(qū)分核酸分子是來自于自身還是外部，因?yàn)殚g隔序列不僅可與外源質(zhì)粒及噬菌體的前間隔序列配對，也可與宿主細(xì)菌的染色體配對，極有可能形成“自身免疫”，殺死宿主細(xì)菌，而前間隔序列鄰近序列是區(qū)分自身序列與外源序列的重要信號，在現(xiàn)有研究報(bào)道中，I 型和II 型CRISPR-Cas系統(tǒng)均是通過該序列識別外源核酸的，III 型系統(tǒng)中暫未發(fā)現(xiàn)前間隔序列鄰近序列的相關(guān)信息[46-47]。

從現(xiàn)有研究結(jié)果可以得出，為獲得耐藥性，不同細(xì)菌對CRISPR-Cas系統(tǒng)的處理方式不同，耐藥能力與CRISPR 的關(guān)系也是不同的，這是因?yàn)榧?xì)菌之間存在差異，所攜帶的CRISPR 亞型在進(jìn)化過程中也發(fā)生變化，從而作用方式不同，最終結(jié)果也不同。

2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌毒性的關(guān)系

CRISPR-Cas系統(tǒng)和毒性的關(guān)系是研究熱點(diǎn)之一，對不同致病菌的研究結(jié)果是不同的（表2）。鏈球菌毒素和毒力因子是通過整合噬菌體基因獲取的，在缺少CRISPR-Cas系統(tǒng)的菌株中存在大量原噬菌體[48]，表明CRISPR-Cas 結(jié)構(gòu)能阻礙鏈球菌對噬菌體的整合，從而減少鏈球菌獲得毒力因子的來源。對于空腸彎曲菌，同樣是小的或缺失CRISPR 陣列的菌株會增強(qiáng)致病能力；導(dǎo)致嚴(yán)重胃腸炎的空腸彎曲菌，其基因組中就是短的CRISPR結(jié)構(gòu)[49]。志賀氏菌致病的主要原因是其毒力基因編碼產(chǎn)物對宿主的侵襲和毒性作用，致病能力取決于細(xì)菌是否存在毒力基因。Bikard 等[36]研究表明CRISPR-Cas系統(tǒng)可以干擾、阻止毒力基因的轉(zhuǎn)移。然而，郭向嬌等[50]發(fā)現(xiàn)，志賀氏菌毒力基因ipaBCD檢出率與CRISPR-Cas系統(tǒng)是否存在無明顯關(guān)系。在另一項(xiàng)志賀氏菌的研究中也得出CRISPR-Cas系統(tǒng)與毒力基因不相關(guān)的結(jié)論[32]，其原因是該研究中使用的菌株均為臨床分離，攜帶毒力基因的幾率高，毒力強(qiáng)，且選擇觀察的毒力基因種類少，因此無法發(fā)現(xiàn)毒力基因和CRISPR 系統(tǒng)之間的聯(lián)系。

表2 食源性致病菌中毒性和耐藥性與CRISPR Locus 狀態(tài)的關(guān)系Table 2 The relationship between the status of CRISPR Locus and toxicity or drug resistance in foodborne pathogens

腸球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)可從兩個(gè)方面調(diào)節(jié)細(xì)菌致病能力：一是當(dāng)攜帶毒力基因的外源DNA侵入腸球菌時(shí)，CRISPR 系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用抵御侵襲，降低細(xì)菌的毒性；二是CRISPR 系統(tǒng)調(diào)節(jié)毒力基因的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)菌的毒力，且促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的定植能力[51]。在小鼠模型試驗(yàn)中，將腸球菌接種到小鼠體內(nèi)，含有CRISPR 的菌株比不含CRISPR 的菌株表現(xiàn)出更強(qiáng)、更快的致死率[52]。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌中存在獨(dú)特的RliB CRISPR 系統(tǒng)，這是一個(gè)嚴(yán)重退化的系統(tǒng)。分析單增李斯特菌不同遺傳譜系的CRISPR 系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)主要致病譜系具有結(jié)構(gòu)組成高度一致的RliB CRISPR 系統(tǒng)，這表明該系統(tǒng)參與單增李斯特菌的毒力調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為它可以通過轉(zhuǎn)錄形成一類特殊的crRNA，從而產(chǎn)生特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，參與毒力調(diào)節(jié)[53-54]。含有退化CRISPR 系統(tǒng)的菌株展現(xiàn)出強(qiáng)毒力[55]的原因在于退化的CRISPR 系統(tǒng)無法發(fā)揮完整CRISPR 結(jié)構(gòu)的作用，不能切割外源核酸，外源毒力基因整合到細(xì)菌基因組中，增強(qiáng)了菌株的毒力。

2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌生物膜的形成

CRISPR 系統(tǒng)還影響細(xì)菌生物膜的形成，從而影響致病菌的傳播、毒性和控制。如攜帶CRISPRCas系統(tǒng)的糞腸球菌具有更強(qiáng)的生物膜形成能力，能更好地抵御外界因素對細(xì)菌的破壞，同時(shí)有效提高細(xì)菌在宿主內(nèi)的定植效率[52]。銅綠假單胞菌的噬菌體DMS3 中的DMS3-42基因是抑制生物膜形成的關(guān)鍵，當(dāng)細(xì)菌擁有完整的CRISPR-Cas系統(tǒng)，且CRISPR 結(jié)構(gòu)的間隔序列不能和DMS3-42 完全匹配時(shí)，噬菌體發(fā)生溶原作用后能夠抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成[56-57]。生物膜是細(xì)菌生存的重要因素，目前對CRISPR 和生物膜的關(guān)系研究尚淺，CRISPR-Cas系統(tǒng)抑制生物膜形成的機(jī)理尚不明確，因此探究二者的關(guān)系對致病菌的防控至關(guān)重要。

2.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌分型上的應(yīng)用

CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌進(jìn)化過程中是動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的。CRISPR 陣列中的間隔序列表明細(xì)菌曾經(jīng)遭遇何種噬菌體、外源質(zhì)粒的侵襲，且整合到基因組中的間隔序列會隨細(xì)菌的分裂復(fù)制被遺傳到下一代?；诖?，CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌分型和溯源方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

2003年，Schouls 等[58]首次使用CRISPR-Cas系統(tǒng)對空腸彎曲菌進(jìn)行分型，揭示種群生物和流行病學(xué)研究中菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在研究CRISPR 分型方法過程中，發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性較低的細(xì)菌CRISPR 分型分辨率高，而多態(tài)性高的細(xì)菌CRISPR 分型分辨率較低，由此表明可將CRISPR分型和其它分型方法結(jié)合對基因多態(tài)性高的細(xì)菌進(jìn)行分型[7]。大腸桿菌的CRISPR 分型常和多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）相結(jié)合[44]。對沙門氏菌進(jìn)行CRISPR 分型，結(jié)果表明其與ST 型、血清型緊密相關(guān)[59]。將CRISPR 分型與多毒力位點(diǎn)序列分型（Multi-virulence-locus sequence typing，MVLST）結(jié)合的CRISPR-MVLST技術(shù)具有追蹤腸炎沙門氏菌主要生態(tài)起源的潛力[60]。CRISPR 分型在區(qū)分不同血清型的菌株、同一血清型的亞型菌株中具有明顯的優(yōu)勢，可開發(fā)為追蹤沙門氏菌病來源并鑒定強(qiáng)毒菌株血清型的有效工具[61]。利用CRISPR-Cas 技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌分型存在的問題有：1）CRISPR 結(jié)構(gòu)中間隔序列具有高度多態(tài)性；2）分型、溯源的關(guān)鍵是間隔序列，而細(xì)菌存在精確刪除間隔序列的行為[6]，無法知曉刪除部分的細(xì)菌遺傳信息，給細(xì)菌分型和溯源帶來一定的困難；3）CRISPR-Cas系統(tǒng)僅存在于45%的細(xì)菌和87%的古細(xì)菌基因組中[6]，并非所有細(xì)菌都能進(jìn)行CRISPR 分型。

3 結(jié)語

對致病菌毒性的研究已從毒力表型深入到毒力基因，對致病菌防控的研究從使用抗生素控制致病菌到研究致病菌的耐藥基因。細(xì)菌中，一部分耐藥基因、毒力基因從外源移動(dòng)遺傳元件獲取，且外源質(zhì)粒、噬菌體與CRISPR-Cas系統(tǒng)密切相關(guān)。在細(xì)菌的生存進(jìn)化過程中，質(zhì)粒和噬菌體攜帶的抗性、毒性基因整合到細(xì)菌基因組中，使細(xì)菌獲得抗性或毒性。而CRISPR 結(jié)構(gòu)阻止了外源核酸的整合，阻斷了細(xì)菌獲得特征性基因的來源，因此，CRISPR-Cas系統(tǒng)也被認(rèn)為是基因水平轉(zhuǎn)移（Horizontal gene gransfer，HGT）的阻礙[8，36，62]。

研究CRISPR-Cas系統(tǒng)的目的在于掌握其所攜帶的生物信息，判斷此系統(tǒng)可否為控制食源性致病菌提供指導(dǎo)作用。如今，研究人員針對細(xì)菌的耐藥性創(chuàng)建了一個(gè)雙噬菌體系統(tǒng)，用噬菌體向細(xì)菌中引入CRISPR-Cas系統(tǒng)，細(xì)菌會刪除相應(yīng)的抗性質(zhì)粒，從而使耐藥細(xì)菌變得敏感，這為處理細(xì)菌的耐藥性提供了有效的解決辦法。鑒于CRISPR-Cas系統(tǒng)對細(xì)菌耐藥性的有效處理，同樣也可以從CRISPR 入手，研究其與細(xì)菌毒性、生物膜形成等其它特征的相關(guān)性。在研究食源性致病菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的過程中，仍有亟待解決的問題，如細(xì)菌選擇整合的間隔序列的標(biāo)準(zhǔn)；不同菌株中CRISPR 位點(diǎn)的數(shù)量不同，多個(gè)CRISPR 位點(diǎn)之間發(fā)揮作用是獨(dú)立、疊加的，還是抑制的；如何將CRISPR 分型和致病菌暴發(fā)的地理來源結(jié)合起來等。本文從多角度綜述CRISPR-Cas 結(jié)構(gòu)及功能信息，為進(jìn)一步挖掘CRISPR-Cas 攜帶的信息、闡明其功能以及研究其對細(xì)菌生物學(xué)特征的影響提供參考依據(jù)。