安 莉，秦冬梅，馬婧瑋，鄭尊濤，廖先駿，吳緒金*

（1 河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所 鄭州450002 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所 北京100125）

山藥（Dioscorea oppositathunb）為薯蕷科（Dioscoreaceae）植物薯蕷的地下塊莖，是我國重要的藥食同源植物資源，廣泛種植于河南、河北、山東、山西和陜西等地區(qū)[1]。山藥中不僅含有豐富的氨基酸、有機酸和糖類等營養(yǎng)成分，還含有山藥素、甾醇、尿囊素和類黃酮等多種功能成分，這使得它同時兼有食用價值和藥用價值[2]。山藥具有“補虛贏、除寒邪熱、補中益氣力、長肌肉、久服耳目聰明、輕身不饑、延年”等功效[3]。當前對山藥的研究主要集中在對其所含有的某一個或某一類成分的分離提取[4-7]、含量測定[8-10]、體外細胞試驗[11-12]以及動物實驗[13-15]等方面。然而，山藥作為食品整體，對人體機體產(chǎn)生的系統(tǒng)性影響研究尚不夠明確，山藥的關鍵功效和營養(yǎng)價值也沒有精準定位，這些都嚴重阻礙著山藥營養(yǎng)功能的深入開發(fā)和利用。明確山藥營養(yǎng)功能定位，探討其對人體的作用機制具有重要的意義。

目前，在藥食同源食品的營養(yǎng)功能上缺乏有效的研究手段來進行系統(tǒng)性預測。近年來，基于系統(tǒng)生物學和計算機技術發(fā)展起來的系統(tǒng)生物信息學[16-17]，將研究對象作為一個完整的系統(tǒng)，通過各種生物信息學數(shù)據(jù)庫提取相關的信息，從分子層面預測并定位出相應研究對象的作用機制，不僅能夠節(jié)約盲目試驗的成本，還可以預測藥食同源食品的營養(yǎng)功能和作用機制，這為藥食同源食品的功能定位研究提供了新的方法和思路。本研究基于生物信息數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學進行數(shù)據(jù)分析和挖掘，探討山藥營養(yǎng)藥理功能及作用機制，以期為山藥作為藥食同源食品的功能開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 山藥中所含化合物的信息獲取

山藥作為藥食同源食品，通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“山藥”為關鍵詞進行檢索，獲得山藥中所含的化合物部分信息，再結(jié)合Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫[18]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取山藥中所含化合物的相關信息。

1.2 山藥中所含化合物的潛在靶點基因的獲取

以所收集到的山藥中所含化合物為研究對象，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別檢索每一個化合物對應的潛在作用靶點。為了便于后續(xù)的分析，將所獲得的靶點名稱，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）轉(zhuǎn)換成相應的基因名稱，形成每一個化合物和所對應靶點基因之間的關系，為后續(xù)網(wǎng)絡分析做準備。

1.3 關聯(lián)網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析

利用Cytoscape（版本號：3.7.2）網(wǎng)絡可視化軟件繪制出山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡，通過其中的Network Analyzer 工具對網(wǎng)絡關系進行分析，獲得相關網(wǎng)絡參數(shù)信息。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析

在String 數(shù)據(jù)分析平臺（https：//string-db.org/）上對潛在靶點基因進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析，構(gòu)建相應的網(wǎng)絡，并進行網(wǎng)絡中相關參數(shù)分析。

1.5 靶點基因的通路分析

利用R 程序語言軟件（版本號：3.6.1）中Cluster Profiler 軟件包對所得到的潛在靶點基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥中所含化合物數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

基于TCMSP 和PubChem 生物信息平臺整合出山藥中66 個化合物的相關信息，包括分子ID、中文名稱、英文名稱、分子式、相對分子質(zhì)量和化合物CID 等，具體信息見表1。

表1 山藥中化合物信息Table 1 Components information of Dioscorea opposita thunb

（續(xù)表1）

2.2 山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建和分析

將山藥中所含化合物的潛在靶點轉(zhuǎn)換成基因名稱后，去除重復基因，共得到131 個與山藥化合物相關的靶點基因，利用Cytoscape 平臺分析，構(gòu)建出山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡，如圖1所示，山藥中所含化合物中的37 個化合物與131 個靶點間有相互聯(lián)系。經(jīng)過網(wǎng)絡拓撲分析可知，包括山藥、化合物和靶點在內(nèi)，節(jié)點數(shù)目（Number of nodes）為169 個，平均相鄰節(jié)點數(shù)（Average number of neighbors）為5.231。節(jié)點的顏色由橙紅到天藍所對應的節(jié)點度（Degree）值由大到小，節(jié)點度值越大表明該化合物作用的靶點越多。網(wǎng)絡拓撲分析（圖2）展示了節(jié)點度值排名在前11 名的化合物，依次為MOL000050 甘氨酸、MOL000042 丙氨酸、MOL000449 豆甾醇、MOL000065 天冬氨酸、MOL003969 絲氨酸、MOL000041 苯丙氨酸、MOL000322 海風藤酮、MOL003971 蘇氨酸、MOL000546 薯蕷皂苷元、MOL000056 酪氨酸和MOL000052 谷氨酸。上述11 個化合物可能為山藥中潛在的發(fā)揮功效的重要化合物群。

圖1 山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡Fig.1 Dioscorea opposita thumb-compound-target network

圖2 山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡中排名前11 位化合物的節(jié)點度值圖Fig.2 Degree graph of the top 11 compounds in the Dioscorea opposita thumb-compound-target network

2.3 山藥中所含化合物作用的靶蛋白的相互作用網(wǎng)絡分析

由圖3 可知，蛋白與蛋白間是通過復雜網(wǎng)絡共同協(xié)調(diào)來系統(tǒng)發(fā)揮作用的。圖中節(jié)點數(shù)越大表明其節(jié)點度值越大。網(wǎng)絡拓撲分析發(fā)現(xiàn)（圖4），節(jié)點度值排名前11 名依次為過氧化氫酶（CAT）、白細胞介素6（IL6）、乳酸脫氫酶B（LDHB）、乳酸脫氫酶A（LDHA）、谷草轉(zhuǎn)氨酶2（GOT2）、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（SHMT2）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶1（SHMT1）、丙糖磷酸異構(gòu)酶1（TPI1）、單胺氧化酶A（MAOA）和磷脂酶C（PC），這些靶蛋白可能為山藥發(fā)揮營養(yǎng)功能的潛在關鍵靶蛋白。

圖3 山藥中所含化合物的潛在靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡Fig.3 The protein interaction network of the potential targets of compounds containted Dioscorea opposita thumb

圖4 山藥中化合物的關鍵靶蛋白節(jié)點度值圖Fig.4 Degree graph of key target proteins of compounds containted Dioscorea opposita thumb

2.4 靶蛋白的KEGG 通路分析

為闡明山藥發(fā)揮營養(yǎng)功能的作用機制，進一步對山藥中所含化合物的潛在靶蛋白的KEGG 通路進行富集分析。以P值、調(diào)控基因通路的基因數(shù)目（Count）和基因比值即位于該KEGG 通路條目上的潛在靶點基因與所有位于該通路條目中的注釋基因總數(shù)比值，且基因比值越大，表明該通路上富集的程度越大。圖5 為富集得到的與營養(yǎng)功能相關的前10 條主要KEGG 通路，富集程度由大到小，分別為神經(jīng)活性配體受體相互作用（Neuroactive ligand-receptorinteraction）、碳 代 謝（Carbon metabolism）、氨基酸的生物合成（Biosynthesis of amino acids）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine，serine and threonine metabolism）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、糖酵解/糖異生（Glycolysis / Gluconeogenesis）、丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝（Alanine，aspartate and glutamate metabolism）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）和精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis），相關KEGG 通路對應潛在的靶點基因如表2所示。

圖5 KEGG 通路富集的氣泡圖Fig.5 Bubble chart of KEGG pathway enrichment

表2 KEGG 通路中富集的潛在靶點基因Table 2 Potential target genes enriched in KEGG pathway

3 討論

生物信息數(shù)據(jù)庫逐漸開始被學者應用于食品科學領域。劉方等[19]利用網(wǎng)絡藥理學的方法分析并預測了了柿果中16 個化合物潛在的作用靶點和信號通路。李娜等[20]通過構(gòu)建“木瓜化合物-靶點-通路網(wǎng)絡”，從分子水平解析了木瓜的作用機制。這些方法的應用為食品科學提供了新的研究方法和思路。為了更好地明確山藥的營養(yǎng)功能和作用機制，本文利用生物信息學方法對生物信息數(shù)據(jù)庫進行了山藥功能定位和機制探討。

對山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡的分析發(fā)現(xiàn)，節(jié)點度值排名前11 的化合物包含8 種氨基酸，分別為甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和谷氨酸；此外還含有植物甾醇1個，為豆甾醇；木脂素類1 個，為海風藤酮；甾體皂苷元1 個，為薯蕷皂苷元，這些物質(zhì)可能是山藥發(fā)揮營養(yǎng)作用的重要化合物。氨基酸作為對生命機體營養(yǎng)、生存和發(fā)展有重要作用的物質(zhì)，不僅在機體信息傳遞和物質(zhì)代謝調(diào)控方面起著重要的作用，而且現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)其有著重要的營養(yǎng)功效，例如有研究就發(fā)現(xiàn)甘氨酸能夠緩解脂多糖刺激導致的腸道能量代謝紊亂[21]，改善糖尿病大鼠的氧化應激損傷[22]，緩解燒傷后大鼠心肌有氧代謝[23]。植物甾醇中的重要組成豆甾醇，營養(yǎng)價值高、生理活性強，在抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及降低血液中膽固醇含量等方面都有重要作用[24]。有研究表明，海風藤酮可抑制炎癥介質(zhì)、減輕自由基損害，緩解急性胰腺炎大鼠的病理癥狀[25-26]。薯蕷皂苷元的藥理作用研究表明，其不僅能夠通過調(diào)整多種細胞細胞信號通路發(fā)揮抗癌作用，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、以及調(diào)血脂等活性[27-28]?？梢?，山藥中靶點最多的化合物在抗氧化、抗炎、調(diào)控機體免疫等方面均發(fā)揮著重要的營養(yǎng)功能。

山藥中所含化合物的潛在作用靶蛋白的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析結(jié)果表明，CAT、IL6、LDHB、LDHA、GOT2、SHMT2、VEGFA、SHMT1、TPI1、MAOA和PC 在網(wǎng)絡中節(jié)點數(shù)最多，其中的CAT 和IL6節(jié)點數(shù)均在30 以上。CAT 作為機體中重要的抗氧化酶，能夠清除過量的過氧化氫，防止膜脂過氧化，減緩生物體內(nèi)與細胞凋亡、細胞衰老、炎癥反應和腫瘤形成等相關的應激反應，在抗氧化防御系統(tǒng)中的發(fā)揮著防御作用[29-30]。IL6 是調(diào)節(jié)宿主免疫應答、炎癥、血細胞生成和癌發(fā)生的多效細胞因子，作為免疫調(diào)節(jié)因子，功能廣泛，與中性粒細胞的分化、凋亡以及單核巨噬細胞表面受體表達等密切相關，其水平的升高與類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、胰島素依賴性糖尿病等自身免疫疾病的發(fā)展密切相關[31-32]。

在KEGG 通路中富集基因最多的是神經(jīng)活性配體受體相互作用通路，該通路中的基因與學習、記憶、情緒、內(nèi)分泌和生理節(jié)律調(diào)節(jié)等密切相關。有研究報道敲除CHRM1和CHRM3基因會降低快速眼動睡眠期的睡眠水平，引起記憶減退并不再做夢[33]。Jones 等[34]發(fā)現(xiàn)CHRM2基因可能影響人的腦活動和智力加工。另外，有6 條氨基酸合成及代謝相關的通路上富集基因也較多，這可能與山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡找出的重點化合物中有8個是氨基酸類相關。與氨基酸的合成及代謝密切相關的糖酵解/糖異生和丙酮酸代謝2 個通路上富集基因也較多，由此可見氨基酸相關通路在山藥發(fā)揮營養(yǎng)功能上發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本研究基于山藥現(xiàn)有化合物和相關靶點生物信息數(shù)據(jù)庫進行了山藥營養(yǎng)功能分析和作用機制探討，構(gòu)建了山藥-化合物-靶點網(wǎng)絡、靶點蛋白之間相互作用網(wǎng)絡以及KEGG 通路富集分析，結(jié)果均顯示出山藥具有潛在的抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)自身免疫及神經(jīng)系統(tǒng)等功效。研究系統(tǒng)揭示了山藥多成分、多靶點、多途徑綜合發(fā)揮作用的特征，為整體把握山藥的營養(yǎng)功能和作用機制研究提供了新的思路，也為山藥作為藥食同源食品的功能開發(fā)提供了科學依據(jù)。