王向陽，盧進(jìn)彬，潘 炎，顧 雙

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

殼聚糖作為天然防腐劑，能夠有效抑制多種細(xì)菌、真菌的生長和繁殖，被廣泛用于食品抑菌、果蔬防腐保鮮等方面。Qiu 等[1]報道2.5 mg/L 高分子殼聚糖和5.0 mg/L 低分子殼聚糖處理綠蘆筍后可延長綠蘆筍采后保鮮期。Sun 等[2]的研究表明水溶性殼聚糖和磺基殼聚糖抑制大腸桿菌的作用較強，抑制金黃葡萄球菌的作用較弱，抑制灰葡萄孢的作用較強，抑制甘蔗節(jié)菱孢的作用較弱。Jia 等[3]的研究表明納米銀粒子殼聚糖對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、霍亂沙門氏菌、葡萄球菌和灰葡萄孢有很強的抑制作用。Sun 等[2]發(fā)現(xiàn)水溶性殼聚糖和磺基殼聚糖對甘蔗節(jié)菱孢菌絲的結(jié)構(gòu)有破壞作用。Jia 等[4]發(fā)現(xiàn)吡啶殼聚糖對灰葡萄孢菌絲結(jié)構(gòu)有損傷和變形作用，從而抑制菌株的生長。李小芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理后，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜發(fā)生滲漏，帶有熒光的殼聚糖前期沒有進(jìn)入菌體細(xì)胞，后期細(xì)菌細(xì)胞出現(xiàn)破裂。Tsai 等[6]發(fā)現(xiàn)殼聚糖使大腸桿菌體內(nèi)的葡萄糖脫氫酶和乳酸脫氫酶外漏，認(rèn)為殼聚糖和細(xì)菌表面的負(fù)電荷組分結(jié)合，增加菌體細(xì)胞膜通透性。Sebti 等[7]認(rèn)為殼聚糖能進(jìn)入細(xì)胞，與胞內(nèi)帶負(fù)電組分（蛋白質(zhì)和核酸）結(jié)合，抑制細(xì)菌的生長。謝勇等[8]在透射電鏡下觀察經(jīng)殼聚糖處理的幽門螺桿菌，發(fā)現(xiàn)幽門螺桿菌的細(xì)胞壁變薄和不完整，其胞質(zhì)內(nèi)容物稀松等現(xiàn)象，認(rèn)為殼聚糖能破壞細(xì)菌外膜結(jié)構(gòu)、功能和通透性，擾亂菌體代謝。鄭連英等[9]認(rèn)為對革蘭氏陰性菌而言，殼聚糖分子質(zhì)量越小，抑菌效果越好；而對革蘭氏陽性菌而言，殼聚糖分子質(zhì)量越大，抗菌效果越明顯。殼聚糖是否進(jìn)入微生物細(xì)胞，目前還沒有一個統(tǒng)一的研究結(jié)論。這可能與殼聚糖分子質(zhì)量、衍生物基團(tuán)、微生物種類的不同有關(guān)。殼聚糖處理會引起細(xì)胞壁、細(xì)胞膜滲漏，然而滲漏程度與生長抑制或死亡的關(guān)系還不清楚。本文選用革蘭氏陽性菌（G+）植物乳桿菌和革蘭氏陰性菌（G-）大腸桿菌以及真菌葡萄酒酵母作為試驗菌種，考察水溶性殼聚糖對它們的抑菌效果，并通過測定電導(dǎo)率和OD260nm考察其變化與菌體抑制或死亡的關(guān)系。測定膜上的脫氫酶和細(xì)胞質(zhì)的β-半乳糖苷酶，考察殼聚糖是否進(jìn)入細(xì)胞，從而分析不同菌的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1）材料 乳酸菌（Lactobacillus plantarum），大腸桿菌（Escherichia coli）均為實驗室保藏菌種。葡萄酒酵母（Saccharomyces ellipsoideus），購于安琪酵母股份有限公司。

2）培養(yǎng)基 乳酸菌采用MRS 肉湯培養(yǎng)基和MRS 瓊脂培養(yǎng)基，大腸桿菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA），酵母菌采用麥芽汁培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），培養(yǎng)基購于杭州百思生物技術(shù)公司。

3）試劑 水溶性殼聚糖（殼聚糖鹽酸鹽，脫乙酰度96.1%，黏度20 mPa·s），購自青島弘海生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、NaCl、氯化三苯基四氮唑（TTC）、Tris-HCl、Na2S、甲醛、丙酮、石油醚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，購自杭州禾德化工有限公司（分析純級）。

4）主要儀器 TGL-16M 高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；DDS-11A 電導(dǎo)儀，上海精科公司；UV-2550 紫外-可見分光光度計，島津公司。

1.2 菌的制備

采用MRS 瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于37 ℃、濕度20%條件下分別培養(yǎng)乳酸菌和大腸桿菌24 h。連續(xù)活化2 代。1 g 酵母于30 ℃、4%葡萄糖溶液中活化30 min 后用麥芽汁培養(yǎng)基于30℃、150 r/min 條件下恒溫培養(yǎng)18 h，然后用PDA培養(yǎng)基于30 ℃、濕度20%條件下培養(yǎng)48 h。

將活化后的菌，用稀釋平板計數(shù)法計數(shù)（見GB 4789 3-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》），制成含菌數(shù)106CFU/mL 左右的菌懸液[10]。

1.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定[11]

采用菌落平板計數(shù)法測定最小抑菌濃度（MIC）。MRS 瓊脂培養(yǎng)基包含0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/L 殼聚糖；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基包含0.25，0.5，1，2，4 mg/L 殼聚糖；PDA 培養(yǎng)基包含0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mg/L 殼聚糖。各培養(yǎng)基于121 ℃滅菌后20 min 與紫外滅菌30 min 后的殼聚糖溶液混合，加入0.1 mL 菌懸液，于37 ℃恒溫（細(xì)菌）或30℃（酵母菌）濕度20%條件下培養(yǎng)24 h（細(xì)菌）或48 h（酵母菌），不長菌的最低濃度為MIC，試驗重復(fù)3 次。

1.4 最小殺菌濃度（MBC）的測定[12]

向0.2 mL 菌懸液中加入2 mL 殼聚糖溶液，使乳酸菌菌懸液中殼聚糖的質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/L，使酵母菌菌懸液中殼聚糖的質(zhì)量濃度為0.4，0.8，1.6，3.2，6.4 mg/L，使大腸桿菌菌懸液中殼聚糖的質(zhì)量濃度為2，4，8，16，32 mg/L，并于37 ℃（細(xì)菌）和30 ℃（酵母菌）培養(yǎng)24 h，取0.1 mL 加入10 mL 各自液體培養(yǎng)基，125 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，以不長菌的最低濃度為MBC，重復(fù)3 次。

1.5 電導(dǎo)率測定

參考馮小強等[13]的方法，進(jìn)行修改。菌培養(yǎng)18 h 后，于4 ℃、5 000 r/min 離心15 min，洗滌3次，用滅菌水制成菌懸液，調(diào)節(jié)OD600nm=0.8。取5 mL 菌懸液和5 mL 殼聚糖溶液混合，使殼聚糖終質(zhì)量濃度為各種菌的MIC 和4MIC，滅菌水代替殼聚糖為對照。37 ℃（細(xì)菌）或30 ℃（酵母）培養(yǎng)0.5，5 h 和9 h（缺少能量，限制增殖）后于4 ℃、5 000 r/min 條件下離心15 min。取上清測定電導(dǎo)率為L2；取5 mL 所加質(zhì)量濃度殼聚糖溶液和5 mL 滅菌水混合，測定電導(dǎo)率為L1；取對照煮沸10 min，同樣離心后，取上清測定電導(dǎo)率為L0，試驗重復(fù)3 次。相對電導(dǎo)率按式（1）計算：

1.6 滲出OD260nm 測定

參考李大鵬等[14]的方法。采用MIC、4MIC 殼聚糖處理菌懸液，以滅菌水代替殼聚糖為對照，37℃（細(xì)菌）或30 ℃（酵母）培養(yǎng)0.5，5 h 和9 h 后4℃、5 000 r/min 離心15 min，取上清液，以相同質(zhì)量濃度殼聚糖溶液為參比，測定波長260 nm 處的吸光度（DNA、RNA 等大分子物質(zhì)滲漏），重復(fù)3次。

1.7 脫氫酶活性的測定

TTC 法是一種通過測定呼吸鏈脫氫酶活性來表征細(xì)胞代謝活力的有效方法，代謝產(chǎn)物三苯基甲腙（TF）呈現(xiàn)紅色，紅色越深，表示菌活力越強。通過492 nm 比色測定還原產(chǎn)生的紅色TF 物質(zhì)的量可以定量判斷菌體內(nèi)脫氫酶活性的大小[15]。TTC在細(xì)胞呼吸過程中替代氧接受H+（H+/e），自身被還原為紅色物質(zhì)TF，用有機溶劑萃取TF，測定TF吸光值，反映了電子傳遞鏈的遞氫能力。OD 值越大，脫氫酶活性越強[16]。脫氫酶活性的測定參考周恢等[17]的方法。采用MIC、4MIC 殼聚糖處理菌懸液，以滅菌水代替殼聚糖為對照，37 ℃（細(xì)菌）或30 ℃（酵母）震蕩培養(yǎng)0.5，5 h 和9 h 后取出。取2 mL 菌液，加入2 mL pH 7.0 的磷酸緩沖溶液、2 mL 4 mg/L TTC 溶液、2 mL 0.1 mol/L 葡萄糖溶液，混勻。37 ℃，黑暗反應(yīng)2 h 后加入1 mL 甲醛終止反應(yīng)，再加入4 mL 丙酮和5 mL 石油醚，37 ℃黑暗震蕩提取10 min，以石油醚為參比，測定波長492 nm 處的吸光度。脫氫酶活性按式（2）計算：

式中，C——TTC 還原量，μg；V——菌懸液體積，mL；t——反應(yīng)時間，h。

1.8 β-半乳糖苷酶活性的測定

MIC 和4MIC 殼聚糖處理菌懸液4 h 后取樣離心獲得菌體。參考朱敏等[18]的方法，0.25 mL 無菌生理鹽水溶解菌體制成菌懸液，加入一滴甲苯，于37 ℃振蕩30 min，使酶釋放。加0.25 mL 0.75 mol/L ONPG 溶液，于30 ℃水浴10 min，測定OD420nm值。酶活力按式（3）計算：

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，利用t檢驗進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對3 種菌的MIC 和MBC

由表1 和表2 可知，殼聚糖對乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌的MIC 分別為0.2，0.4，2 mg/L。殼聚糖對乳酸菌的生長抑制作用最強，酵母菌次之，大腸桿菌最弱，敏感性相差較大，殼聚糖對大腸桿菌的MIC 是乳酸菌的10 倍，是酵母菌的5 倍。

表1 殼聚糖對乳酸菌和酵母菌的MICTable 1 The MIC of chitosan for L.plantarum and S.ellipsoideus

表2 殼聚糖對大腸桿菌的MICTable 2 The MIC of chitosan for E.coli

由表3 和表4 可知，殼聚糖對乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌的MBC 分別為0.8，3.2，16 mg/L。殼聚糖對乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌的MBC/MIC 比值分別是4 倍、8 倍、8 倍。

表3 殼聚糖對乳酸菌和酵母菌的MBCTable 3 The MBC of chitosan for L.plantarum and S.ellipsoideus

表4 殼聚糖對大腸桿菌的MBCTable 4 The MBC of chitosan of E.coli

2.2 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對菌株相對電導(dǎo)率和OD260nm 值的影響

當(dāng)微生物細(xì)胞膜遭到破壞時，其內(nèi)部電解質(zhì)會外泄至細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞外液體的電導(dǎo)率上升，相對電導(dǎo)率反映的是細(xì)胞膜對小分子的離子滲漏阻隔性能。當(dāng)細(xì)胞膜遭到較大破壞時，胞內(nèi)大分子物質(zhì)如核酸等也會從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外。核酸在波長260 nm 處有很強的紫外吸收，測定細(xì)胞外的電導(dǎo)率和OD260nm有助于判斷菌體細(xì)胞膜破壞程度。試驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖對菌株電導(dǎo)率的影響很大，可能是因為殼聚糖本身帶有離子或螯合離子。另外，培養(yǎng)基和生理鹽水中含有的離子對電導(dǎo)率測定也有很大干擾。本研究經(jīng)過多次試驗后，發(fā)現(xiàn)菌體培養(yǎng)后，通過離心去除培養(yǎng)基可以減少培養(yǎng)基的離子干擾。此外，菌體在加入的殼聚糖溶液和滅菌水中生長，在測定相對電導(dǎo)率時，也可通過扣除因添加殼聚糖引起的電導(dǎo)率變化來消除殼聚糖對電導(dǎo)率測定的影響。

4MIC 殼聚糖處理后3 種菌的相對電導(dǎo)率和OD260nm值都顯著上升，且顯著高于MIC 殼聚糖處理后菌株的相對電導(dǎo)率和OD260nm值。4MIC 殼聚糖處理乳酸菌的相對電導(dǎo)率，在0.5 h 上升425%，9 h 上升701%，OD260nm值分別上升125%和262%。MIC 處理后的乳酸菌相對電導(dǎo)率分別上升100%和289%，OD260nm值分別上升12.5%（不顯著）和71%（圖1a 和b），說明4MIC 殼聚糖已經(jīng)顯著促進(jìn)離子和核酸外流，MIC 殼聚糖對核酸外滲作用的促進(jìn)作用較弱。

4MIC 殼聚糖處理大腸桿菌的相對電導(dǎo)率在0.5 h 上升350%，9 h 上升415%，OD260nm值分別上升71%和89%；MIC 殼聚糖處理大腸桿菌的電導(dǎo)率在0.5 h 和9 h 分別上升36%和91%，OD260nm值在0.5 h 和9 h 分別下降23%和11%（圖1c 和d）。MIC 殼聚糖處理大腸桿菌比MIC 殼聚糖處理乳酸菌的離子滲漏少，說明MIC 殼聚糖促進(jìn)乳酸菌核酸滲漏，但沒有促進(jìn)核酸外滲。而受MIC 殼聚糖處理的大腸桿菌OD260nm值下降，可能是殼聚糖有凝結(jié)作用，大腸桿菌MIC 高，殼聚糖添加量特別大，容易降低背景吸收。高濃度殼聚糖對大腸桿菌的抑菌效果好，低濃度殼聚糖效果差。

4MIC 處理酵母菌的相對電導(dǎo)率，在0.5 h 上升了268%，9 h 上升了238%，OD260nm值分別上升169%和164%，前期增加非常明顯；MIC 處理酵母電導(dǎo)率上升196%和137%，OD260nm值分別上升111%和150%（圖1e 和f）。低濃度和高濃度對酵母抑制效果類似。

圖1 殼聚糖對3種微生物相對電導(dǎo)率和OD260nm 的影響Fig.1 The effect of chitosans on the relative conductivity and OD260nm of three kinds of microorganisms

2.3 殼聚糖對菌內(nèi)脫氫酶和β-半乳糖苷酶活性的影響

脫氫酶與氧化磷酸化有關(guān)，主要存在真核生物的線粒體膜上[19]。細(xì)菌沒有線粒體，脫氫酶主要在細(xì)胞膜上。3 種菌對照都有較大的吸收值，均呈現(xiàn)紅色（見圖2 和圖3），說明脫氫酶活力正常，TTC 能夠通過酵母菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞與線粒體膜上的脫氫酶反應(yīng)，然而酵母菌紅色低于細(xì)菌，說明TTC 進(jìn)入細(xì)胞膜較難，進(jìn)入量較少。

乳酸菌經(jīng)過MIC 和4MIC 質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液處理以后，與對照組相比，其脫氫酶活性均顯著降低。4MIC 和MIC 殼聚糖對乳酸菌，在0.5 h分別達(dá)到93%和77.8%的抑制率，9 h 脫氫酶活性極低，說明殼聚糖能夠快速透過乳酸菌細(xì)胞壁，并抑制細(xì)胞膜上脫氫酶（見圖2a）。

大腸桿菌試驗添加殼聚糖質(zhì)量濃度高，對大腸桿菌絮凝較強，引起菌體沉淀，每次搖均勻后測定。4MIC 和MIC 殼聚糖處理大腸桿菌后，脫氫酶活性變化比較小，說明大腸桿菌的細(xì)胞壁對殼聚糖的阻隔性很好（圖2b）。

圖2 殼聚糖對3種微生物細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶活性的影響Fig.2 The effect of chitosans on the dehydrogenase activities in three kinds of microorganisms

酵母菌經(jīng)過MIC 和4MIC 質(zhì)量濃度殼聚糖溶液處理以后，其脫氫酶活性均在第0.5 小時就被完全抑制，說明殼聚糖能夠經(jīng)過酵母菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，抑制了細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活性。

對照微生物都懸浮在液體中，3 種菌經(jīng)過殼聚糖處理后都有沉淀，說明殼聚糖對3 種菌體都產(chǎn)生絮凝作用，微生物主要在沉淀中。乳酸菌上清液還有一些渾濁，說明殼聚糖對菌體沉淀不徹底，而大腸桿菌和酵母菌上清液非常澄清，說明殼聚糖對大腸桿菌和酵母菌絮凝作用很強。培養(yǎng)0.5 h，對照組的乳酸菌和大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶活力很強，溶液顏色呈現(xiàn)紅色，而對照組的酵母菌溶液顏色呈淡紅色，可能因為TTC 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，到達(dá)線粒體膜較少。4MIC 和MIC 殼聚糖處理乳酸菌和酵母菌的沉淀和上清液都呈無色，說明乳酸菌細(xì)胞膜和酵母菌線粒體膜的脫氫酶受到抑制，而4MIC 和MIC 殼聚糖處理的大腸桿菌沉淀呈現(xiàn)紅色，說明大腸桿菌細(xì)胞膜的脫氫酶沒有受到抑制（見圖3），殼聚糖可能容易透過乳酸菌細(xì)胞壁作用于細(xì)胞膜上的脫氫酶，透過酵母菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用于線粒體膜的脫氫酶，而沒有大量透過大腸桿菌細(xì)胞壁，故幾乎不抑制其細(xì)胞膜上的脫氫酶活力。

圖3 經(jīng)過殼聚糖處理的3 種微生物脫氫酶活性照片（0.5 h）Fig.3 The photos of dehydrogenase activities in three kinds of microorganisms treated with chitosan（0.5 h）

表5 殼聚糖對3種微生物細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性的影響（U）Table 5 The effect of chitosans on the β-galactosidase activities in three kinds of microorganisms（U）

β-半乳糖苷酶屬于胞內(nèi)物質(zhì)，因此前人常用β-半乳糖苷酶滲出細(xì)胞濃度代表細(xì)胞膜破損情況。3 種菌經(jīng)MIC 殼聚糖處理后其細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶活性顯著下降，此時MIC 殼聚糖完全能抑制3 種菌的繁殖，但是去除殼聚糖后，3 種菌又繼續(xù)生長，反而延緩了菌株個體的壽命。β-半乳糖苷酶的活性下降是由該酶被結(jié)合引起的，還是由細(xì)胞膜滲漏導(dǎo)致胞內(nèi)酶減少引起的尚不清楚。4MIC 殼聚糖處理乳酸菌和酵母菌后，其細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶活力均比MIC 殼聚糖處理高，說明殼聚糖過多進(jìn)入細(xì)胞引發(fā)菌體的衰老或逆境反應(yīng)，導(dǎo)致了β-半乳糖苷酶的合成。只有4MIC 殼聚糖處理大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活力相比MIC殼聚糖處理大腸桿菌的β-半乳糖苷酶活力進(jìn)一步受到抑制，這可能與殼聚糖較難進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞有關(guān)。

殼聚糖對非膜上酶——β-半乳糖苷酶的抑制強度較弱，而對膜上酶——脫氫酶的抑制很強，說明殼聚糖可能主要抑制膜上酶。進(jìn)入細(xì)胞后，可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸?shù)竭_(dá)細(xì)胞器膜，而不是在細(xì)胞質(zhì)的溶液中擴散。

3 討論

水溶性殼聚糖對3 種菌的MBC/MIC 比值為4～8 倍，這和Sun 等[2]報道水溶性殼聚糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的兩者比值類似。然而，本研究結(jié)果顯示大腸桿菌的MIC 為2 mg/L，MBC 為16 mg/L，與Sun 等[2]的報道不一致，可能與培養(yǎng)基或水溶性殼聚糖pH 值差異有關(guān)，大腸桿菌對酸很敏感。

本研究發(fā)現(xiàn)水溶性殼聚糖對乳酸菌和酵母菌的抑菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對大腸桿菌的抑菌活性。這與Hong 等[19]研究得出水溶性殼聚糖對G+菌的抑制作用強于G-的結(jié)論相符。但Sun 等[2]報道稱水溶性殼聚糖對金黃色葡萄球菌（G+）的MIC 為2 mg/mL 高于大腸桿菌，說明G-菌更加敏感。Chen 等[20]認(rèn)為水溶性殼聚糖對G-的抑制作用強于G+菌。另外Sun 等[2]報道殼聚糖對甘蔗節(jié)菱孢的MIC 和MBC 均為16 mg/mL，對灰葡萄孢的MIC 和MBC均為0.13 mg/mL，說明其對霉菌和細(xì)菌的抑制差異很大。殼聚糖對微生物并非都起抑制作用，吳智艷等[21]報道稱0.05～0.125 mg/mL 的殼聚糖處理可促進(jìn)平菇菌絲生長。綜上所述，殼聚糖的抑菌機理仍然不夠清楚，存在未知干擾因素，導(dǎo)致抑菌效果不穩(wěn)定。

MIC 殼聚糖處理乳酸菌、大腸桿菌、酵母0.5 h 后相對電導(dǎo)率分別是對照2，1.4，3 倍，而4MIC殼聚糖處理組分別是4.3，4.0，4.4 倍。MIC 殼聚糖處理乳酸菌、大腸桿菌、酵母0.5 h 后OD260nm值是對照1.1，-0.8，2.1 倍，4MIC 殼聚糖處理OD260nm值分別是2.2，2.0，2.3 倍。差距非常大。由于我們平時測定的相對電導(dǎo)率上升幅度較小，該數(shù)值不足于作為評價菌是否死亡的指標(biāo)。原因可能是菌體外溶液中本身含有大量離子，導(dǎo)致檢測的菌體相對電導(dǎo)率變化幅度很小。致死微生物滲出的相對電導(dǎo)率是對照的4 倍，滲出的OD260nm值是對照的2 倍。李小芳等[5]報道稱堿性磷酸酶存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁間隙中，β-半乳糖苷酶存在于細(xì)胞膜的內(nèi)部，而核酸存在于質(zhì)膜內(nèi)部，一般不會分泌到細(xì)胞外部。殼聚糖處理后，堿性磷酸酶首先被釋放，而后是β-半乳糖苷酶泄漏。殼聚糖處理0.5 h 后菌液中OD260nm和OD280nm值顯著升高，可能是殼聚糖對細(xì)胞壁和細(xì)胞膜磷脂雙層結(jié)構(gòu)都有影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物泄露。

本試驗測定了細(xì)胞內(nèi)非膜上的β-半乳糖苷酶，該酶存在于溶酶體、液泡或細(xì)胞質(zhì)中。作為誘導(dǎo)酶，平時該酶的活性很低，如果用半乳糖或乳糖誘導(dǎo)，則β-半乳糖苷酶會大量合成。β-半乳糖苷酶也可作為衰老指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞衰老時，β-半乳糖苷酶活性上調(diào)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖處理導(dǎo)致乳酸菌和酵母菌的脫氫酶活性受到顯著抑制，而大腸桿菌沒有受到顯著抑制，3 種菌的β-半乳糖苷酶活性受到抑制較輕，這說明殼聚糖能夠透過乳酸菌和酵母菌細(xì)胞壁，而較難透過大腸桿菌的細(xì)胞壁，這可能與它們的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成有關(guān)。乳酸菌是G+細(xì)菌，含90%肽聚糖和10%磷壁酸，兩者都帶負(fù)電荷，細(xì)胞壁雖厚但容易透過親水物質(zhì)。殼聚糖也稱殼糖胺，脫乙酰后帶有NH3+基團(tuán)，帶正電，故殼聚糖容易與乳酸菌細(xì)胞壁結(jié)合。大腸桿菌是G-細(xì)菌，細(xì)胞壁雖薄但包含外膜和肽聚糖內(nèi)層。外膜分3 層，外層是脂多糖（LPS），內(nèi)層是脂蛋白，中間是磷脂雙分子層。其中脂質(zhì)雙層類似細(xì)胞膜，是細(xì)胞壁阻隔大分子物質(zhì)的主要屏障。LPS 含類脂，也有阻隔作用，然而LPS 帶有負(fù)電荷，能與殼聚糖結(jié)合。脫乙酰度高的殼聚糖，具有破壞LPS 結(jié)構(gòu)的能力。酵母細(xì)胞壁雖厚，但殼聚糖卻容易透過。原因是酵母細(xì)胞壁的主要成分是多糖，細(xì)胞壁內(nèi)層是葡聚糖、外層是甘露糖，中間是蛋白質(zhì)，均為親水物質(zhì)，因此殼聚糖相對容易透過。

研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能顯著抑制乳酸菌和酵母菌的脫氫酶活性，前者位于細(xì)胞膜上，后者位于線粒體膜上，說明殼聚糖能夠快速進(jìn)入酵母菌細(xì)胞內(nèi)。Li 等[23]報道稱體外殼聚糖的加入會改變牛血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)，并引起牛血清白蛋白熒光猝滅，即殼聚糖與酶相遇可能會導(dǎo)致酶活性顯著下降。Jia 等[3-4]報道稱銀粒子殼聚糖納米顆?？梢鸹移咸焰呔z原生質(zhì)體濃縮，細(xì)胞壁破裂。吡啶-殼聚糖處理灰葡萄球菌會引起嚴(yán)重的形態(tài)學(xué)改變。李小芳等[5]報道稱殼聚糖處理導(dǎo)致細(xì)菌形態(tài)變化，細(xì)胞表面變得模糊，甚至出現(xiàn)破碎細(xì)胞，采用FITC 標(biāo)記殼聚糖處理金黃葡萄球菌，通過激光共聚焦發(fā)現(xiàn)，處理后培養(yǎng)30 min 時，帶有熒光的殼聚糖在菌體外圍成一圈，無法進(jìn)菌體細(xì)胞內(nèi)部；培養(yǎng)24 h 時，殼聚糖殺死菌體，熒光呈現(xiàn)破碎狀，說明殼聚糖不只是透過細(xì)胞壁，還會破壞細(xì)胞壁，并且對細(xì)胞膜也有破壞作用。

殼聚糖可能具有抑制細(xì)菌基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的作用，然而殼聚糖進(jìn)入真核細(xì)胞后，如何避過各種蛋白等結(jié)合，直達(dá)細(xì)胞核和線粒體，仍值得研究。王瓊等[24]應(yīng)用熒光定量PCR 發(fā)現(xiàn)6.0 g/L 殼聚糖可抑制金黃葡萄球菌的腸毒素基因轉(zhuǎn)錄，但沒有說明菌的數(shù)量是否一致。劉曉非等[25]報道稱低分子殼聚糖和羧甲基殼聚糖處理大腸桿菌后，殼聚糖能與mRNA 探針結(jié)合，從而阻礙mRNA 探針和DNA 結(jié)合。李小芳等[26]發(fā)現(xiàn)體外DNA 與殼聚糖能夠結(jié)合，認(rèn)為殼聚糖可能有一部分進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部，與DNA 之間由靜電作用形成新的復(fù)合物，導(dǎo)致DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而抑制細(xì)菌的繁殖。張小燕等[27]報道稱2.5 g/L 低分子殼聚糖對變形鏈球菌生物膜作用15 min 后，菌體參與轉(zhuǎn)運功能、感受態(tài)、信號傳導(dǎo)的基因顯著上調(diào)；而參與能量代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的基因顯著下調(diào)。本試驗發(fā)現(xiàn)殼聚糖對酵母脫氫酶抑制作用很強，對β-半乳糖苷酶活性抑制作用較弱。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)主要采用膜泡運輸方式[18]，殼聚糖進(jìn)入細(xì)胞后，可能不是溶解于液體移動，而是通過膜泡運輸。殼聚糖的抑菌能力的強弱關(guān)鍵可能取決于其透過細(xì)胞壁的能力，以及對細(xì)胞膜的破壞程度。

4 結(jié)論

水溶性殼聚糖抑制乳酸菌最強，其次是酵母菌，大腸桿菌最弱。這取決于微生物細(xì)胞壁對殼聚糖的阻隔性。4MIC 殼聚糖對3 種菌破壞強烈。MIC 殼聚糖容易透過酵母菌的細(xì)胞壁，且能迅速破壞酵母菌細(xì)胞膜。MIC 殼聚糖也容易透過乳酸菌細(xì)胞壁，并對乳酸菌細(xì)胞膜破壞速度較慢，但是強度較大。MIC 殼聚糖處理大腸桿菌后，細(xì)胞膜只是離子滲漏增加，大分子核酸滲漏較少，說明殼聚糖不容易透過細(xì)胞壁。殼聚糖對乳酸菌細(xì)胞膜上脫氫酶和酵母菌線粒體脫氫酶的抑制很強，對大腸桿菌細(xì)胞膜脫氫酶的抑制較弱。殼聚糖對細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)和酵母菌溶酶體中的β-半乳糖苷酶活性抑制作用較弱。綜上所述，殼聚糖進(jìn)入菌體細(xì)胞后，可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜泡進(jìn)行移動。